2013人教版选修一课题3《血红蛋白的提取和分离》ppt课件2.pptVIP

装配好的凝胶柱 （3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 （3）样品加入与洗脱 注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 收集得到的纯化后的蛋白 4、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 选做 目的： 鉴定血红蛋白纯度。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定血红蛋白纯度 （1）试剂的配制 ①丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺? 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液 ②十二烷基硫酸钠（SDS）? 用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。 ③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液 ④ TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 ⑤用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。 ⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液? 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。 ⑦样品处理液? 50 mmol/L Tris—HCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。 ⑧染色液? 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸 ⑨脱色液? 10%的甲醇和10%的冰醋酸。 由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。 ① SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备 1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备 用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。 （2）电泳方法步骤 ③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。 ②分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。 3）样品处理　 5)加样 在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100 ℃温度下加热3 min，以使蛋白质变性。 按顺序加样，加样量通常为10—25 μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品 4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 7）剥胶 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。 8）染色 将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h。 6)电泳　 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。 10)观察结果： SDS电泳的成功关键之