牙菌斑、唾液和龈沟液的采集和处理.ppt

实验注意事项： 要设阳性和阴性对照。 细菌浓度对实验结果的影响 浓度低可导致假阴性结果，最佳的细菌浓度为 2.1×1010/ml～2.4×1010/ml,如菌浓度略低可适当延长酶反应时间。 酶反应时间与菌种的关系 酶反应时间因不同菌种有所差异，以4小时～24 小时为宜。 待测标本放置时间 以新鲜的放置24小时～48小时培养物为宜。如标本不能 立即做生化实验，可将其放置在4℃冰箱内，时间最好不超过96小时。 预成酶微量生化实验所用细菌应来自不加血的非选择培养基，以避免产生 假阳性结果。 实验报告： 变异链球菌的分离与鉴定。 思考题： 变异链球菌的菌细胞形态特征、菌落特征、耐氧特征和生化反应特征主要有哪些？ 牙菌斑、唾液和龈沟液的采集和处理 二次细菌定植 （Secondary bacteria colonization) 先锋菌pioneer 定植colonize 环境改变(environment changes) 个体(individual) 生物体的社会 群体 (community) 极期群落 (climax community) 一、菌斑的采集 二、唾液的收集 三、龈沟液的采集和处理 四、标本运送 五、标本的分散和稀释 一、菌斑的采集 1、 牙合面沟裂和邻面菌斑的采集 2 、根面菌斑的采集 3 、龈上或龈缘菌斑的采集 4 、龈下菌斑的采集 S.mutans与龋病关系密切，但数量2%初期链球菌 唾液中某种微生物浓度与附着量呈正相关 第一个细胞附着至牙面所需细菌浓度 S.mutans 104~105/ml saliva S.sanguis 103/ml 1、 合面沟裂和邻面菌斑的采集 漱口去除口内食物残渣 隔湿 小挖匙或探针采集 牙线或正畸用的细钢丝采集邻面菌斑标本 隔湿 探针采集 2 、根面菌斑的采集 3 、龈上或龈缘菌斑的采集 漱口 隔湿 显色 无菌匙形器采集 4 、龈下菌斑的采集 带有充气导管的采集器 可卸式取菌器 纸尖 刮除龈上菌斑后漱口，棉卷隔湿，将灭菌纸尖直接插如龈沟或牙周袋内，停留10s取出，放预还原传送培养基中。 匙形器 刺激唾液 非刺激唾液 二、唾液的收集 最佳采集时间：晨起后，刷牙洗漱前或两餐之间 漱口 吐唾法 唾液收集器 三、龈沟液的采集和处理 选用Whatman 3 号滤纸剪成2?10mm纸片 刮除龈上菌斑 漱口 隔湿 沟内法：滤纸前端轻插入龈沟入口处，当感到阻力时再向龈沟深部插入，约30s后取出，放入传送液中。 沟外法：滤纸片紧贴于牙面、龈缘、附着龈上，使龈沟液慢慢渗至纸上 1. 滤纸吸着法 ①龈沟内采集法 ②牙周袋内采集法 龈沟或牙周袋的龈下菌斑采集法 2. 毛细管法 将细的毛细管置于龈沟口处，凭毛吸作用将龈沟液吸入管内 四、标本运送 1ml的硫乙醇盐 （硫乙醇酸钠0.15g，磷酸氢二钠0.11g，氯化钠0.5g，加三蒸水100ml，加热溶解，冷却到50度，加新鲜配制的1％Cacl2 0.9ml，高压灭菌） 收集好菌斑后用0.5ml无菌石蜡加盖 五、标本的分散和稀释 超声 震荡 （可加玻璃珠 ） 1. 分散 十倍系列稀释法 菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。 2 稀释 全平板CFU=每平方厘米平均菌落数×πr2（平均面积）1 ml标本中活菌数=全平板CFU×稀释倍数 如果两个相邻稀释度菌落平均数均在30~300之间，则计数其比值：比值＜2，报告两个稀释度的平均菌落数；比值≥2，报告两个稀释度中较大的菌落数。 如果只有一个稀释度的平均菌落数在30~300之间，则以该平均菌落数乘以稀释倍数报告。 如果稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。 如果所有稀释度均未见菌落，则报告小于10，而不报告0。 实验步骤 1.采集龈上菌斑 2.分散标本 3.十倍系列稀释 4.涂平皿 实验方法： 漱口、隔湿→刮取牙面菌斑 立即置转送液中密闭 震荡、分散菌斑团块 涂片 接种和培养 次代培养 生化鉴定 菌斑采集和处理 染色 观察 分类 革兰染色涂片 观察、细菌表型鉴定 革兰染色步骤： 细菌涂片加热固定 加革兰（碱性结晶紫）甲液、乙液各一滴，混匀后初染30秒 革兰碘液媒染30秒 丙酮-乙醇混合脱色剂脱色5～10秒 石炭酸复红复染5秒 干燥后1000倍显微镜油镜下观察 水洗 水洗 水洗 水洗 表型鉴定——（1）菌落特征观察 初代培养的菌落观察要点： 形态：如水滴状、圆形、丝状、不规则状、