《酶工程》课件酶的提取与分离纯化.pptVIP

酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （五）凝胶层析（分子筛层析、凝胶过滤、分子排阻层析） 5、特点 （1）优点 （2）缺点 A、适合生物大分子的分离纯化。 B、分离条件温和。 C、选择性和分辨率高，活性收率较高。 D、应用广，可工业应用。 稀释度高，操作不易掌握。 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （六） 亲和层析 1、亲和层析的概念 是指利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的技术。 2、原理 依据目的物与专性配基的相互作用进行分离。 亲和层析原理示意图 （一） E S′ E- S′ 图1 酶E与底物S′反应生成酶底复合物E- S′。 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （六） 亲和层析 2、原理 亲和层析原理示意图 （一） M 图2 M-L 图3 M-L M –L-S 活性母体M与具有识别能力的配基L以共价键的方式形成亲和层析剂M-L。 亲和层析剂与混合液中有效成分S结合产生偶联复合物M-L-S和杂质。 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （六） 亲和层析 2、原理 亲和层析原理示意图（一） M-LS M-L 图4 偶联复合物M-L-S经解离后，得到纯有效成分S。 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （六） 亲和层析 2、原理 亲和层析原理示意图 （二） （1） 亲和层析法的固定相为一固相担体，上有专一性亲和基团 (A)，流动相为溶离缓冲液。 （2）当样本通过管柱时，与亲和基团有专一性的分子 (B) 结合到固定相上，非一专性分子 (X) 则随流动相洗出管柱。 （3）留在定相上的分子 (B)，可用酸或碱溶离，或用专一性游离分子溶离。 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （六） 亲和层析 3、亲和层析剂 （1）亲和层析剂的组成 亲和层析剂由配基、母体组成。对于以小分子化合物作配基时，还有连接臂。 ① 配基(体) 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基，配基必须偶联于不溶性母体上。 ② 母体（载体、担体或基质）） 常用母体：凝胶（琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺）、纤维素。 母体活化：不溶性母体必须先活化，才能与配基偶联或通过连接臂与配基偶联。 ③连接臂 连接小分子化合物配基与母体之间的桥梁。 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （六） 亲和层析 3、亲和层析剂 （2）亲和层析剂的配制 ①根据要分离物质的特性，选择与之配对的分子作为配基。 ②根据配基分子的大小及所含基团的特性选择适宜的偶联凝胶作为母体。 ③在一定条件下，使配基与母体偶联结合，制成亲和层析剂。 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （六） 亲和层析 4、亲和法四项要素 （1） 对所要纯化的物质 (B)，需有专一性配体 ligand (A)，而 A, B 之间要有专一性亲和力。 （4） A-B 结合成的 复合体 (complex)，可以方便地解离，而不伤害 A 或 B。 （2）配体 (A) 能方便而大量取得，且能经由耦合反应接到固相担体上，成为固定相。 （3）担体具有可与配体连结的基团，且非专一性吸附力低，通透性良好。 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （六） 亲和层析 5、特 点 优点 缺点 （1）选择性极高，纯化倍数和效率高，生物活性收率高。 （1）成本高。 （2）能从较复杂的混合物中直接分离目的的产物。 （2）配基亲和稳定性差，使用寿命有限。 （3）亲和材料制备复杂。 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （七）分配层析 1、相关概念 （1）分配层析 是指利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。 （2）分配系数 ①概念：是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。 ②计算： 分配系数K=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度 ③ 影响因素：溶剂和溶质的性质、温度和压力等。 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （七）分配层析 2、原理 是利用不同溶质的分配系数不同，移动速度不同，而使各组分分离。 3、分类 ①纸上层析 ②分配薄层层析 ③分配气相层析 酶的提取与分离纯化 六、层析分离 （七）分配层析 4、纸上层析 操作过程 （1）点样 （2）层析 （3）显色 酶的提取与分离纯化 七、 电泳分离 （一）电泳的概念 指带电粒在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。 （二）原理