基因操作的 工具酶PPT课件.pptVIP

????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ; 基因的体外操作需要工具酶;限制酶类像“剪刀” 连接酶类像“胶棒” 对DNA实施操作;工具酶类;基因操作的工具酶;限制与修饰系统的发现;限制与修饰系统的发现;限制与修饰作用; 注：外来的噬菌体DNA被切割（右）而细菌本身DNA不被切割（左） ;限制与修饰系统的意义;;名称;菌株;限制性核酸内切酶的分类;主要特性;;三类限制酶的作用特点（2）;三类限制酶的作用特点（3）;; Ⅱ型 限制性核酸内切酶;限制性内切酶的应用;Ⅱ型限制酶的基本特性（1）;?Ⅱ型限制酶的基本特性（2）;Ⅱ型限制酶的基本特性（3）;;末端形式（2）： 3′突出粘末端 5′……C－T－G－C－A↓G……3′ 3′……G↑A－C－G－T－C……5′ PstⅠ 5′……C－T－G－C－A G……3′ 3′……G A－C－G－T－C……5′ ;末端形式（3）： 平末端 5′……CCCGGG……3′ 3′……GGGCCC……5′ SmaⅠ 5′……CCC GGG……3′ 3′ ……GGG CCC……5′ ;部分限制酶及其酶切结果;限制性核酸内切酶名称;关于限制酶的几个概念;关于限制酶的几个概念（1）;关于限制酶的几个概念（2）;关于限制酶的几个概念（3） 酶切位点出现的频率;限制酶识别序列在DNA分子中出现的频率 （理论上） 44 ＝ 256 46 ＝ 4096 前提条件：四种碱基随机排列，数量相等。;关于限制酶的几个概念（4） 同裂酶（isoschizomers） ;关于限制酶的几个概念（5） 同尾酶（isoaudarner）;同 尾 酶 的 作 用 特 点;黏性末端;★?号活性（star activity）;★产生“星号”活性的因素;限制酶的切割位点一般在识别序列内部 如：HindⅢ 5′---A↓AGCTT---3′ Sma I 5′---CCC↓GGG---3′ PstI 5′---CTGCA↓G---3′ 少数限制酶???切割位点在识别序列的两侧 如： Sau3AI 5′---↓GATC---3′ NlaⅢ 5′---CATG↓---3′ EcoRⅡ 5′---↓CCAGG---3′;限制酶对切割序列的要求;限制性核酸内切酶;限制酶对切割序列的要求; 限制酶的切割具有位点偏爱（site preferences）现象。研究发现切割位点侧翼序列的核苷酸组成与限制酶的切割效率也有关系。 例如在pBR332 DNA上有限制性核酸内切酶NaeI的4个识别序列，在未经过特殊位点甲基化修饰的情况下，其中两个识别序列可迅速被NaeI切割，第3个识别序列稍缓切割，而位于1285处的第4个识别序列，切割效率只有其他识别序列的1/15。这意味着，当酶促反应系统作用一定时间后，3个识别序列（403、771和931的位置）完全被Nae I切割时，而1285位置的识别序列只是部分被切割。 这种现象被认为与限制酶识别序列两侧的核苷酸组成有关，称为位点偏爱。;DNA限制酶图谱（restriction map）;λDNA的限制图谱;限制酶消化反应条件;影响限制性核酸内切酶活性的因素 ;影响限制性核酸内切酶活性的因素 ;酶;（四）限制性核酸内切酶的缓冲液 限制性核酸内切酶的标准缓冲液的组分包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCl、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清蛋白（BSA）。酶活性的正常发挥，是绝对需要二价的阳离子，通常是Mg2+。Tris-HCl的作用是使反应混合物的pH恒