类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术知识.pptVIP

TALEN介导的基因组定点修饰技术 组员:邓树庆 王亚光 蒋锐 叶小刚 严晓东 陈浩 彭继伟 魏邦鸿 指导老师：王锐 对复杂的基因组进行定点修饰, 无论对于生物学基础研究还是临床治疗都具有极大的吸引力。 类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶。 为什么要研究人工核酸内切酶呢？ 因为人工构建的序列特异性核酸内切酶能识别并切割特定的DNA靶序列，造成双链断裂，从而引起基因组结构的定点改变。 一、TALEN的发展 1989年，人们发现了TALE蛋白家族的第一个成员AvrBs3 TALE 蛋白类似于真核生物的转录因子，可以通过识别特异的DNA 序列调控宿主植物内源基因的表达，从而提高宿主对该病原体的易感性。 2. 2009年，揭示了 TALE 蛋白特异结合宿主基因启动子的机制 TALE的结构： TALEN：Transcription activator-like effector nuclease 类转录激活因子效应物核酸酶 N端 转运信号 AD： 转录激活结构域 C端 核定位信号 介导其与DNA特异识别与结合的结构域 重要 3. 2011年，首次把TALE与FokI结合在一起组成TALEN,并证 实了TALEN在靶基因操作中的能力 2012年，我国科学家施一公带领的团队通过解析 TALE 蛋 白的晶体结构，清晰地揭示了 TALE 蛋白特异识别DNA 的机理 …… 类转录激活因子效应物核酸酶由特异性的TALE DNA 结合结构域和非特异性FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。 TALEN 能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列, 造成DNA 双链断裂, 从而诱导该靶序列产生indel突变, 目前已成功地应用于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。 利用TALEN基因敲除小鼠 20世纪 80 年代末诞生了第一个基因敲除的小鼠(Mus musculus)模型, 科研工作者从此能够选择性地修改载有生命密码的基因组, 探讨基因的功能 TALEN--基因组的“巡航导弹” TALEN 既能够像 ZFN 一样精确地修饰复杂的基因组, 又具有比 ZFN 更容易设计的优点； TALEN介导的基因组编辑技术在 2012 年 1 月被 Nature Methods 杂志评选为2011年度最受瞩目、最有影响力的年度生命科学技术； 2012 年 12 月被 Science 杂志评为 2012 年度十大科学进展之一。Science 在评述中把 TALEN 称为基因组的“巡航导弹”。 TALEN 的结构示意图 TALE 蛋白 N 端一般有转运信号，C 端有核定位信号和转录激活结构域,中部则是介导其与DNA特异识别与结合的结构域。 TALE 蛋白的中部包含一段很长的、串联排列的重复序列, 是其DNA 结合结构域的一个重要组成部分, 具有特异性识别并结合特异 DNA 序列的特性。 在每个重复单位中, +12 和+13 位的氨基酸残基是实现靶向识别特异 DNA 碱基的关键位点, 随靶点核苷酸序列的不同而异, 被称作重复可变双残基(Repeat variable di-residue, RVD); 其他位置的氨基酸残基则相对固定。不同的 RVD 能够相对特异地分别识别 A、T、C、G 4 种碱基中的一种或多种。 其中分别与这 4 种碱基相对应的最常见的 4 种 RVD 分别是 NI (Asn Ile)、NG (Asn Gly)、HD(His Asp) 和 NN (Asn AsnTALE 的重复单元跟靶序列具有很好的一一对应性 。 TALE靶点识别模块构建 TALE是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基 (RVDs)位点。TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基。 TALEN 实现 DNA 定点切割的原理示意图 把 TALE 中的转录激活结构域(AD)替换成FokⅠ核酸内切酶, 构建成 TALE 核酸酶, 对基因组的特定靶位点进行定向切割, 从而实现基因打靶。 TALENs的作用机制 将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALENs。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22碱基）的靶序列（一般16