儿童细菌性腹泻大肠菌群的的分离及遗传特性研究（ppt版）课件.pptVIP

儿童细菌性腹泻大肠菌群的分离及遗传特性研究 总述 除了传统的临床检测措施外,分子生物学技术如ERIC-PCR、RAPD、16S rDNA PCR-RFLP等已大量应用到大肠埃希氏菌的检测中,具有检测准确、迅速的优点 。 将传统的大肠埃希氏菌分离技术与现代分子生物学技术结合,开展某区儿童细菌性腹泻大肠菌群的分离及遗传特性研究,为某区开展儿童细菌性腹泻防疫防控提供依据。 材料与方法 1. 材料 1.1 样品获得 1.2 主要试剂 1.3 PCR引物 2. 方法 2.1 大肠埃希菌的分离与镜鉴 2.2 大肠埃希菌的生化鉴定 材料与方法 2.3 大肠埃希菌的16S rDNA鉴定分析 2.3.1 菌株基因组DNA的提取与检测 2.3.2 16SrDNA目的序列的扩增、检测 2.3.3 16SrDNA构建聚类树状图 2.3.4 16SrDNA测序及序列比较 3.大肠菌群的16SrDNA PCR-RFLP 16SrDNA-RFLP酶切 16SrDNA-RFLP酶切 16S rDNA序列系统发育树 16S rDNA系统发育 分析与讨论 EMB分离分析 本实验表明该地区儿童大肠杆菌群有10个类群。其中以大肠埃希氏菌为主，其比率超过50%，其次是克雷白氏杆菌比率为21.6%，弗氏柠檬酸杆菌占有率8.1%，其他菌占有率18.9%。表明该地区大肠杆菌群多样性非常丰富。 本研究中，引起腹泻的病原细菌多，如条件致病菌弗氏柠檬酸杆菌，克雷白氏杆菌，大肠埃希菌，费格森埃希菌等。值得注意的是，4-2，21-3与E. coli O157同源性分别达99.6%，99.9%，说明在雅安导致小儿腹泻的病原细菌中，有E. coli O157存在，由于E.coli O157会导致人严重的腹泻甚至还有死亡病例，因此必须重视该地区儿童细菌性腹泻情况。同时应及时追踪检测，以防止大面积爆发儿童腹泻病例。 5%乳糖发酵中，样品4所分离到的4个菌株均只产酸不产气，而其余33个菌株均既产酸又产气。按传统检验法该4个菌株应该判为非大肠埃希氏菌，在后续实验，其甲基红实验为阳性，枸橼酸盐利用实验为阴性，符合大肠埃希氏菌生化特征。其表型可能和遗传型之间存在差异。16S rDNA-RFLP和16S rDNA序列表明：该菌株在16Sr DNA-RFLP中最大的那个遗传群，序列与E.coli O157:H7的相似性竟达99.6%，至于为何其在5%乳糖发酵管中只产酸不产气，其原因还不清楚。 4-2 产酸不产气的可能的代谢原因 5%乳糖发酵试验 5%乳糖发酵试验 DNA检测 16SrDNA扩增产物 MSP酶切 THANK YOU ! 甲基红试验 枸橼酸盐利用试验 枸橼酸盐利用试验 返回 返回 下一页 * 上一页 * 一、 总述 二、材料与方法 三、实验结果 四、分析与讨论 概要 五、结论 急性细菌感染性腹泻病是儿童的常见病、多发病,也是造成婴幼儿营养不良、生长发育障碍的主要原因之一。常见腹泻致病菌有志贺菌、侵袭性大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、肺炎克雷伯菌等。 不同区域,不同季节,不同年代,不同年龄,不同风俗习惯等,其大肠埃希氏菌的分布,类别,流行性,致病性等均有很大不同 总述 节首 节首 结果 64.9% 83.8% 89.2% 阳性率 24 31 33 阳性菌株 枸橼酸盐 甲基红 5%乳糖 检测项目 1. EMB选择培养基培养后,31份样品中有9 份样品检测出肠杆菌,其检出率29%。获得肠杆菌37株。 生化鉴定后初步表明有大肠埃希菌18株 2. 3.2 16SrDNA PCR 3.3 16SrDNA-RFLP酶切 3.4 16SrDNA序列系统发育树 节首 3.1 总DNA提取 1. 结果表明，16S rDNA PCR-RFLP聚类分析结果中，37个菌株在90%的相似水平上聚在一起，在97.5%左右的相似水平上，37个菌株形成了10个类群。 2. 群Ⅰ最大，由4-1，4-2等19个菌株组成；群Ⅱ次之，由7个菌株组成；群Ⅲ由菌株1-3，30-1，30-8组成；群Ⅳ包括菌株25-2和30-2； 3. 其余6个菌株单独构成不同群。 返回 C.freundii DSM 30039 R. planticola ATCC 33531T K . pneumoniae DSM 30104 T 99 1-3 E.vulneris ATCC 33821 E.blatt