化学生物学 化学物质及蛋白质的相互作用.pptVIP

第六章 化学物质与蛋白质的相互作用 一、沉淀作用的类型 1．可逆沉淀(非变性沉淀 ) 一、沉淀作用的类型 2．不可逆沉淀（变性沉淀 ） 二、沉淀剂的类型 第三节 化学物质对蛋白质侧链基团的共价修饰作用 2．蛋白质分子中的可反应基团 氨基酸的氨基和羧基 丝氨酸和苏氨酸所特有的羟基 半胱氨酸的巯基 精氨酸的胍基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸中的酚基 色氨酸的吲哚基 第四节 蛋白质光谱探针 考马斯亮蓝G-250测蛋白质含量 1．巯基的化学修饰 烷基化试剂（碘乙酸、碘乙酰胺 ） 多肽链氨基酸顺序分析过程中防止半胱氨酸的氧化 N-乙基马来酰亚胺 有较强专一性和光吸收的变化，易于确定反应程度 5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB） 有机汞试剂（对氯汞苯甲酸 ） 溶于水中形成羟基衍生物，与巯基相互作用时在255nm处光吸收具有较大的增强效应 2．氨基的化学修饰 非质子化赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团 三硝基苯磺酸（TNBS）与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收 2,4-二硝基氟苯（DNFD）法、丹磺酰氯（DNS）法和苯异硫氰酸酯（PITC）法都是常用的氨基修饰方法。 3．羧基的化学修饰 水溶性的碳化二亚胺类化合物 4．咪唑基的化学修饰 组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。焦碳酸二乙酯（DPC）是最常用的修饰组氨酸残基的试剂。 5．酚和脂肪族羟基的化学修饰 四硝基甲烷（TNM）是酪氨酸残基修饰最常用的修饰试剂 6．胍基的化学修饰 丁二酮或1，2-环乙二酮与胍基反应可逆地生成精氨酸-丁二酮复合物 苯乙二醛可以与精氨酸残基不可逆的结合 4-羟基-3-硝基苯乙二醛可使被修饰的精氨酸残基在405nm处具有光吸收效应。 对硝基苯乙二醛修饰精氨酸残基可以得到具有旋光性的惟一产物，在pH9.0的情况下可以用340nm处光吸收值来定量。 三、亲和性标记 亲和性标记试剂的优点： 能够选择性地结合在蛋白质分子的表面上的特定部位 具有饱和性，与底物或天然配体竞争蛋白质分子的结合位点。 两种类型 光亲和标记试剂 自杀性抑制剂 紫外吸收或荧光光谱进行蛋白质的定量分析的理论基础： 蛋白质含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基，在280nm附近有最大光吸收，并且在340~350nm有荧光发射 。 蛋白质光谱探针：就是能与蛋白质发生相互作用的无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性质发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。 一、蛋白质吸光探针 1．金属探针 （1）双缩脲法 双缩脲在碱性溶液中与铜离子（Cu2+） 生成紫红色化合物的反应，可在540 nm测量吸光度 紫 红 色 （2）Folin-Lowry法 产物最大光吸收波长：640 nm 优点：比双缩脲法灵敏100倍 缺点：反应受多种因素干扰，在显色灵敏度方面存在差异。 应用范围：本法可测定范围是25~250μg/mL蛋白质 （3）二喹啉甲酸法（BCA，bicinchoninic acid ） 原理： 碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与铜离子反应生成Cu＋，Cu＋再与BCA反应形成紫色络合物，在565nm测量吸光度。 优点： 试剂稳定，干扰少，各种蛋白质之间显色差异小 2．染料探针 原理： 利用蛋白质与染料结合成沉淀或改变结合染料的光吸收特性，借助染料颜色的减退或变化的程度来测定蛋白质的含量。 λ＝600nm λ＝ 595nm 优点： 使用方便，反应时间短，染色稳定，对显色时间不严格要求，抗干扰性强，为常用的蛋白浓度测定方法。 该法线性范围1~2 μg/mL，是灵敏度最高的染料探针分析方法。 二、蛋白质荧光探针 作为一个好的荧光探针应满足以下条件： ①探针分子与蛋白质分子的某一微区必须有特异性的结合，并且结合比较牢固。 ②探针的荧光必须对环境条件敏感。 ③蛋白质分子与探针结合后不影响其原来的结构和特性。 在满足这些条件的基础上可进行蛋白质的测定及与金属离子结合的计量化学等。 常用的蛋白质荧光探针 1-苯氨基-8-萘磺酸（ANS） 与组合蛋白质在酸性条件下结合时能产生很强的荧光，激发峰位于375nm，荧光峰位于500nm，可用于组蛋白含量的测定 常用的蛋白质荧光探针 αβγδ-四（对磺苯基）卟啉（TPPS4） 微量蛋白质对TPPS4具有荧光猝灭作用，可以测定纳克级的蛋白质。 常用的蛋白质荧光探针 2-对甲苯氨基萘-6-磺酸（TNS） 1-（N-二甲胺）萘-5-磺酸（DNS） 荧光胺 αβγδ-四（对羧苯基）卟咻（TCPP） 铬天青S 吖啶橙 三、蛋白质光散射探