MDA GSH 蛋白方法--陈远华(修订).doc

Beutler改良法测定GSH操作规程 原理及意义 原理：DTNB能被-SH基团还原，产生等克分子的2-硝基-5-巯基苯甲酸，而苯甲酸阴离子呈黄色，在412 nm波长下。 意义：还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）是一种低分子自由基清除剂，它可清除O2˙ 、H2O2、LOOH。GSH是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物所必需，能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤，最近还证明GSH也参与使Vit E恢复到还原态的作用。GSH测定值的高低可间接反映机体发生氧化损伤的程度。 可见光分光计7 ml离心管加样器试剂 ① 1 mmol/L的GSH② 1％柠檬酸钠③ 二硫双基苯甲酸（dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB）试剂：用1％柠檬酸钠配0.04％（w/v）④ 20％三氯醋酸⑤ 0.3 mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）缓冲液步骤 1、样品处理及试验步骤（下面以肝脏组织为例） 称取一定量的肝脏组织于0.85％生理盐水中漂洗，滤纸吸干水分，烧杯内剪碎 制备20%组织匀浆液（须用0.85％生理盐水或三蒸水） 4000 g离心10 min后取上清液 按上清液:20％三氯醋酸（体积比）为2:1混合（留20 μl上清液用Lowry法测蛋白） 混匀，4000 g离心10 min（此步离心要充分，可适当提高离心力） 收集上清液按表2测定。 2、按下表1绘制标准曲线（单位：ml） 表1 GSH标准曲线的测定 GSH（μmol/L） 0 10 20 30 40 50 1 mmol/L的GSH 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 三蒸水 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 磷酸盐缓冲液 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 DTNB试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，5 min内于412nm比色，以三蒸水调零，以标准GSH浓度为X轴，相应吸光值为Y轴，绘制标准曲线，并求回归方程。 3、按下表2操作测定样品GSH（单位：ml） 表2 Beutler改良法样品测定操作 试 剂 测定管 空白管 待测样品液 0.1 0 磷酸盐缓冲液 4.4 4.4 DTNB试剂 0.5 0.5 三蒸水 0 0.1 测得的吸光值代入回归方程，可计算出样品液的GSH浓度。 实验结果 1、标准曲线结果 GSH浓度（μmol） 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 A值 0.000 0.126 0.260 0.394 0.529 0.666 根据上数据测得标准曲线方程为： X(μmol)=0.3744898 Y+0.0017227（其中Y为吸光值，标准曲线看Figure 1） Figure 1 GSH标准曲线图 注意事项 样品应冰上匀浆，所有步骤尽量保证低温下操作，否则结果偏低； 所有用水均需三蒸水，否则结果偏低； 未经蛋白变性处理的样品在－20℃不宜存放； 反应管内最终PH值必须保证在8.0～9.0间，否则结果不稳定； 配好的DTNB应在有限期内使用（4℃下可存1个月）； GSH浓度低时显色快，消退也快；浓度高时显色慢，消退也慢，一般反应1～5 min后测定（最好不要超过5 min）； 反应总体积可调为2.5 ml。 Beutler改良法”。 Beutler E, Duron O, Kelly BM. Improved method for the determination of blood glutathione[J]. J Lab. Clin. Med. 1963, 61: 882-890. （陈远华） 组织MDA测定操作规程 一、原理与意义 原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（Malondialdehyde, MDA）可与硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid, TBA）缩合，形成红色产物硫代巴比妥酸反应物（Thiobarbituric acid-reactive substance, TBARS），在532nm处有最大吸收峰。 意义：机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，使组织细胞受损伤，并由此形成脂质过氧化物，如：MDA等。MDA的高低间接反应机体细胞的氧化损伤程度。 二、仪器 可见光分光光度计，95℃水浴锅（或普通铝锅开盖煮沸），低速离心机。7ml塑料试管。 三、试剂 试剂盒组成配置如下（50T和100T）： 50T试剂盒组成与配制： 试剂一：液体