分子遗传标记在中药中的应用PPT课件.pptVIP

DNA分子遗传标记在中药中的应用 ;DNA分子遗传标记 ;三、基于PCR的分子标记：根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增。 随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）。随机引物扩增PCR（Arbitrary Primer-PCR,AP-PCR） ;2、DNA扩增产物指纹分析（DNA amplification fingerprinting,DAF）:与RAPD技术不同的是引物浓度更高，长度更短（5～8个bp），只有2个温度循环（在RAPD中是3个温度循环），一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3、特征扩增区段测序（Sequence-characterized amplified regions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目标RAPD片段进行测序，根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，24bp），再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来，可重复性高。;RFLP技术及其应用 ;基本原理 ;DNA多态性根据其产生的两种基本方式;;RFLP与镰状细胞贫血;基本实验步骤;RFLP的优点及局限性 ;RFLP用于???缘关系分析;RFLP在中药材鉴别中的应用 ;RAPD技术及其应用 ;RAPD技术基本原理;RAPD: randomly amplified polymorphic DNA;基本实验步骤 ;RAPD分析的优越性和不足;不足： （1）重复性不高。RAPD在扩增反应时使用的是低温复性(通常为36℃),特异性不高,引物与模板间有较高的错配率,结果容易受到多种因素的影响,不同的实验室这间有时不能重复； （2）对模板DNA质量要求高，操作要求严格，检验成本相对较高； （3）由于存在共迁移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一条带中可能含有不同的扩增产物； （4）RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型，不能有效的鉴定出杂合子。;M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 ; 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112M ;M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ; M 1 2 3 4 5 6 CK 7 8 9 10 11 12 ;图4 不同复性温度对RAPD带型的影响 Fig 4 Effect on RAPD profiles in different annealing temperature ;RAPD分析在中药研究中的应用 ;AFLP技术及其应用 ;AFLP基本原理 ;基本实验步骤 ;AFLP的实验过程;AFLP反应流程： AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有： 首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。 酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。 DNA片段的预扩增。 在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。 PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。 多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。 ;为什么用双酶解?;为什么要预扩增?;;AFLPs;;;荧光标记全自动AFLP;AFLP技术特点;AFLP的重复性问题;AFLP在分子中药中的应用 ;微卫星标记分析（SSR）;SSR位点标记的优点;SSR位点标记的缺点;SSR标记的应用领域;Comparison among genetic markers;由微卫星衍生的微卫星标记 ;ISSR(Intersimple sequence repeat) 这是Zietkiewitcz等(1994)发展起来的又一种微卫星基础上的分子标记。 与SSR标记相反，该法是直接利用同位素标记的SSR序列为引物，用PCR的方法扩增两个SSR之间的单拷贝序列。 为增加特异性，设计引物时在引物的5′端和3′端分别引入1～2个选择性碱基，引物长度16～18bp，扩增产物通过放射自显影显现，这样其扩增物就是MP-PCR扩增产物中的一部分，提高了实验结果的可重复性。 ISSR引物的开发不象SSR引物一样需测序获得SSR两测的单拷贝序列，开发费用降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不象SSR标记一样具有较强的种特异性；与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有