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全内反射荧光显微镜 2015现代生物仪器分析 1.?全内反射的基本理论? 全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy ,TIRFM)：是利用全内反射产生的隐失波激发样品，从而使样品表面一百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面，单分子的活动情况。 由于隐失波强度成指数衰减，使激发区域限定在样品表面的一薄层范围内，因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比。它是当今世界上研究单分子科学最具前途的新型生物光学显微技术之一，可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。 从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中，是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，而振幅随离界面的距离ｚ作指数衰减。 这种电磁场只存在于界面附近一薄层内，因此，我们称此非均匀场为隐失场。隐失波激发一薄层范围之内的荧光分子发出荧光。 2.?全内反射的仪器组成 到目前为止，已经发展了多种全内反射荧光显微镜成像系统。其中最为普遍的有两种类型：棱镜型和物镜型。 2.1棱镜型 棱镜型利用激光经过棱镜并产生全内反射，其隐失波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所以样品大小和样品的放置受到限制。 2.2 物镜型 而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。 2.3全内反射荧光显微镜特点 ①信噪比高（相对共聚焦显微镜） ②分辨率高（相对其他的光学显微镜） ③对生物样本损伤小，可以进行活体物质的研究和单分子的动态研究。 ④全内反射的荧光激发深度只在～100 nm 的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。 ⑤全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像,大大提高了成像速度,可以满足实时成像的要求。 3.?物镜型光学成像系统中物镜? 由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值孔径（NA）必须大于1.38。 当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围（最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.65-1.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大，降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型全内反射荧光成像系统的关键。 4.?生物单分子荧光探测 真正意义上的单分子荧光探测，有很多的困难，但是还是可能的。单分子荧光探测主要有三个问题：（1）单分子发出的荧光信号通常是很微弱的，所以要寻找一个足够灵敏的探测器。（2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光，极大的干扰了信号光的探测。所以应该尽量降低背景激发光。（3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景光。 这些问题都可以利用全内反射荧光显微成像系统来解决。 超灵敏的探测设备如单光子计数的雪崩光电二极管，单光子检测的科学CCD照相机。CCD相机分为两种：制冷型和快速型制冷型CCD?非常灵敏,可以实现荧光弱信号的探测。 全内反射显微成像是采用隐失波照明。隐失波在平行界面方向以行波场方式传播,在垂直界面方向则是一个指数衰减场。所以这种显微成像技术成像的视野开阔，同时探测样品的厚度却很薄，约为百纳米量级，从而解决了问题（2）和（3），可以将拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光减小到极低的水平，也使得在百纳米量级范围以外的本体溶液因为没有激发而得已解决。 5.?在生物单分子研究中的应用? 细胞内的很多至关重要的生命活动过程如信号转导，蛋白质转运，病原体侵入均与细胞表面有关，如果我们可以直接对这些细胞表面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰，这对细胞生物学研究来说，将是具有重大意义的突破。全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势,它的荧光激发深度只在～200ｎｍ的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。 * * 全内反射是一种普遍存在的光学现象。 考虑一束平面光波从折射率