发酵工程(李)第十六章讲稿.docVIP

第十六章 固定化酶与固定化细胞技术 第一节 概述 溶性酶的缺点： 1 大部分酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响） 2 不能回收，无法自动化、连续化生产 3 专一性高 1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。 1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。 1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。 1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。 (1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简 化了提纯工艺。 (2) 可在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。 (3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。 (4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 (5) 酶使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。 固定化酶的缺点： (1) 酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。 (2) 比较适应水溶性底物和小分子底物。 (3) 与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后才能固定化。 1、四大类方法：吸附法；包埋法；结合法；交联法 2、选择方法依据： （1）酶的性质（2）载体的性质（3）制备方 法的选择 在具体选择时，一般应遵循以下几个原则。 （1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。 （2）酶与载体必须有一定的结合程度。 （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。 （6）固定化酶的成本适中。 3、固定化后酶的考察项目： （1）测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率 （2）考察固定化酶稳定性 （3）考察固定化酶最适反应条件 二、酶的固定化方法 （一） 吸附法 吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。 酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。 （1） 物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶直接吸附在水 不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。是制备固定化酶最早采用的方 法，α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此法进行固定化。 常用载体： 1mg蛋白/克吸附剂 有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂 研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷 物理吸附法制备固定化酶，操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后，活性部位及空间构象变化不大，故所制得的固定化酶活力较高。 靠物理吸附作用，酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，所以使用受到限制。常与交联法结合使用。 2）离子吸附法 离子吸附法(ion adsorption)是将酶与含有离子交换基团的水不溶性 载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结 合的固定化方法。 此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等， 在工业上用途较广。 DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶： 将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNa0H和水洗涤 加入pH7.0-7.5的米曲霉3042粗酶液 (水解乙酰-DL-Ala活力为25umol/ml·h) 充分混合，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液 (1g湿重载体加60ml酶液) 固定化酶活力回收50-60％ 用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。 水解乙酰-DL-A1a活力为600-800umol/g·h湿固定化酶。 阴离子交换剂有DEAE-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等； 阳离子交换剂有羧甲基纤维素、纤维素柠檬酸盐等。 其吸附容量一般大于物理吸附剂。 离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。 吸附力弱，不适宜的pH，高盐浓度，高底物浓度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。 提高吸附容量和吸附力的途径： 1 选择最佳条件操作（如温度、pH）。 2 选吸附量大的载体，控制酶和载体量。 3 采用高酶量吸附。 4