四川省岳池县第一中学2014-2015学年高中生物 专题5 课题3 1课时 多聚酶链式反应扩增DNA片段学案.docVIP

血红蛋白的提取和分离 学习目标1. 尝试对血液中血红蛋白的提取和分离。2. 提取生物大分子的基本过程和方法。3. 了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。学重点凝胶色谱法的原理和方法。学难点样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 凝胶色谱法又称作 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是由 构成的多孔球体，在小球内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶的速度不同。相对分子质量较小蛋白质 进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量较 蛋白质 无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速率 。 2.缓冲液 缓冲液的作用是： 。 3.电泳 电泳是指 。电泳利用待分离样品中个分子 以及分子本身 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。两种常用的电泳方法分别是 和 。在测定蛋白质分子量是一般用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于 以及 等因素。 知识注解 （一）凝胶色谱法 1.概念 被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。 2.凝胶 多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 3.原理 ①、当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。 ②、而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 ③、依据的特性是：蛋白质分子量的大小。 （二）缓冲溶液 1.概念：在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。 2.作用:能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。 在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液，目的是:利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)。 （三） 电泳 1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理 ： ①、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。 ②、在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③、电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3.类型：琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 聚丙稀酰胺（SDS）凝胶电泳 1.在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 2.原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入 3.SDS作用机理:SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 预习自测题 1．凝胶色谱法可以有效的分离蛋白质的根据是（ ） A．分子的大小 B．相对分子质量的大小 C．带电荷的多少 D．溶解度 2．能进入凝胶内部通道的蛋白质是指（ ） A．相对分子质量大的 B．吸附性高的 C．相对分子质量小的 D．溶解度低的 我的疑问 学始于疑 用什么方法来分离样品中的蛋白还能保持蛋白活性？ 课内探究 质疑探究 1.有鸡红细胞提取DNA，用哺乳动物红细胞提取血红蛋白的原因？ 2.在实验过程中为什么要不断用磷酸缓冲液处理? 3.聚丙稀