激光扫描共显微镜2.docVIP

激光扫描共焦显微镜技术的应用 Confocal主要应用特点： 形态学观察与检测：亚细胞器定位，如最简单的核定位 二维定位、定量 三维定位、图像重组 生理学测量： 动态测量：实时检测 静态测量： ( 活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量(Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) （动态/静态） (自由基的检测（动态/静态） (药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 (蛋白质的转位（动态/静态） 激光扫描共焦显微镜技术的应用 活细胞内H+浓度(pH值)的测量（动态/静态） 线粒体膜电位的测量（动态/静态） 光谱测量 蛋白质功能检测 荧光漂白恢复（FRAP）的测量和FLIP 荧光能量共振转移(FRET)的测量(动态/静态） 光活化和光转化检测 其他应用 激光扫描共焦显微镜技术的应用 一、形态学观察与检测 免疫荧光标记(单标、双标或三 标) 如：细胞膜受体、某种蛋白或酶的分布与表达，细胞骨架的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与亚细胞器的共定位、核转录因子转位、细胞的增值、分化 细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位杂交-fitc + PI 8-氧脱氧鸟苷 激光扫描共焦显微镜技术的应用 荧光原位杂交： 染色体基因定位 单细胞凝胶电泳 GFP融合蛋白的表达 蛋白的核转位 荧光标记 1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白 免疫荧光标记： 与抗体耦联, 直标: 一抗+荧光探针 间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗体+荧光探针) TubulinTracker?：Oregon Green? 488 Taxol bis-acetate：紫衫醇 肌动蛋白actin ( Palloidine+荧光探针Tritc) 2)细胞膜表面受体与胞内受体（活细胞） 配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2) 标记 Gm1: 霍乱毒素受体： 霍乱毒素+FITC 标记 Ip3受体： Heparin＋FITC TfR受体：转铁蛋白＋TRITC 荧光染料的重要特性 光谱特性:激发光谱和发射光谱 光量子产率：特定条件下为常数，每个染料分子的荧光强度与光量子产率成正比。 摩尔吸光系数：代表染料对激发光的吸收能力 光稳定性，光漂白性 PH稳定性 特异性和毒性 定位、定量研究中常用荧光探针 Green Red Far-Red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (异硫氰基荧光素) (四甲基异硫氰基罗丹明) Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 Cy5.5 532 (藻红蛋白) Cy7 633 Texas Red 595/615 350 (德州红) 405 Cy3 558/568 BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618 Alexa Fluor 染料 Alexa Fluor 染料— 是一系列高亮度的卓越染料，他们的优点如下： 亮度 — Alexa Fluor 比相似发射光谱的染料的荧光更强。 光稳定性— Alexa Fluor 比其他的荧光染料的光稳定性好，可更长时间采集图像 颜色可选择性好 — Alexa Fluor 提供从蓝色到红色不同的颜色可选择。 强