荧光光度法测定酸奎尼丁含量.docVIP

院系：医学检验系 班级：检验本科1班 姓名:常一鸣 荧光光度法测定硫酸奎尼丁含量 实验目的和要求 1 、掌握荧光分光光度计的基本结构及操作方法； 了解荧光产生及测量的过程； 掌握荧光分析法的定量分析方法（标准曲线法）； 掌握影响荧光强度的因素。 实验原理 硫酸奎尼丁的分子结构如图所示，可分为喹啉环和喹啉碱两个部分，根据其喹啉环结构部分具有产生荧光的特性，采用荧光光度计测量其荧光强度，可实现硫酸奎尼丁含量的测定。 实验仪器与试剂 ①F93型荧光光度计 ②硫酸奎尼丁标准储备溶液（100μg/ml） ③硫酸溶液（0.050mol/L） ④硫酸奎尼丁样品溶液 ⑤50ml容量瓶6个 ⑥5ml移液管2只 ⑦1cm石英荧光比色皿1个 实验步骤 标准系列溶液及样品溶液配制 按照下表配制硫酸奎尼丁标准系列溶液及样品溶液 编 号 1 2 3 4 5 6（硫酸奎尼丁样品溶液） 100μg/ml硫酸奎尼丁标准溶液 1.00ml 2.00ml 3.00ml 4.00ml 5.00ml 2.50ml 说明 以上溶液均用移液管移取至50ml容量瓶中 用0.050mol/L硫酸溶液稀释至刻度并摇匀 系列标准溶液浓度 2μg/ml 4μg/ml 6μg/ml 8μg/ml 10μg/ml —— 荧光光谱的绘制 在激发波长在365nm的条件下，将荧光波长调节为380nm，用1cm石英荧光比色皿，以5号溶液作为测定溶液，置于荧光光度计样品室中，盖上样品室舱盖，调节荧光光度计灵敏度，然后按照下表依次调节荧光波长，测定不同荧光波长下5号溶液的荧光强度；以测定的荧光强度为纵坐标，荧光波长为横坐标绘图，绘制荧光光谱，并找出最大荧光波长。 激发波长 365nm 荧光波长 380nm 390nm 400nm 410nm 420nm 430nm 440nm 450nm 460nm 荧光强度值 0.6 2.2 6.0 12.8 18.6 22.6 24.4 23.8 21.1 激发波长 365nm 荧光波长 470nm 480nm 500nm 510nm 520nm 530nm 540nm 550nm 560nm 荧光强度值 18.1 17.1 10.6 6.9 4.5 2.7 1.6 0.8 0.5 选择的最大荧光长为λ=440nm 3、标准曲线制作 将荧光波长调节为上面实验选择的λ=440nm，荧光光度计灵敏度调节为上面实验选择的灵敏度档次；用1cm石英荧光比色皿，按照下表依次测定标准系列溶液和样品溶液荧光强度；在坐标纸上以荧光强度为纵坐标，系列标准溶液的浓度为横坐标制图，绘制标准曲线。 编 号 1 2 3 4 5 6（样品） 硫酸空白值 荧光强度 5.3 10.9 15.3 20.0 24.4 6.9 0.0 实验数据处理 样品溶液中的硫酸奎尼丁含量计算 根据6号样品溶液荧光强度的测定值，在标准曲线上采用作图法求出其对应的浓度值，采用下式计算样品溶液中铁的含量： Cx=C读取值 × 根据标准曲线求出待测样品浓度值C读取值=（6.9-0.99)/2.365=2.50(μg/ml)，则样品溶液中铁的含量 Cx=50.00μg/ml。 实验注意事项 测定系列标准溶液和样品溶液时，必须使用同一只比色皿。 比色皿放入荧光光度计样品室前，必须用吸水纸将外表面擦拭干净。 比色皿在换装不同浓度溶液时，必须用待测溶液润洗至少三次。 在比色皿未放入荧光光度计测定光路时，必须将样品室舱盖打开。 实验讨论 调节荧光光度灵敏度时，如何选择最佳档数？ 将档数从最低档依次调到最高档，在每一档的时候，调节荧光波长使之从短波长到长波长，比较所对应的荧光强度，最后选择最大荧光强度尽可能的大但不大于150所对应的档。 在此次实验过程中，为什么没有进行调零操作？ 调零主要是为了避免溶液中的溶剂的拉曼光（或瑞利光）谱与待测物的荧光光谱发生重叠，对测定产生误差。而此次实验当中，能够对实验测试产生影响的是溶剂0.05mol/L?H2SO4在激发光下产生拉曼光。据查，在320