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* 第六章 DNA 体外重组与重组分子导入受体细胞 DNA体外重组是指目的基因DNA片段与适当载体在DNA连接酶的作用下连接形成重组DNA分子的过程。 第一节 重组DNA分子的构建 一、DNA体外重组必须考虑的因素： ①实验步骤简单易行； ②连接效率较高； ③选择载体要易于重组子筛选； ④选择的连接方式要便于回收插入的外源DNA片段； ⑤外源基因必须在表达载体DNA的启动子控制之下，并置于正确的阅读框架之中。 二、外源基因片段与载体的连接方式 1、黏性末端连接法(黏性末端法) ①单酶切黏性末端连接法 优点：实验操作简单，易于回收外源DNA片段。 缺点：a、载体易自身环化； b、克隆不定向；c、难插入特定的基因(两端具有不同酶切位点)；d、大片段DNA的重组率较低；e、片段间串联连接，给筛选和分析带来困难。 插入式黏性末端连接法 碱性磷酸酶处理线性DNA载体防止载体自身环化 ②双酶切黏性末端连接法 (取代式黏性末端连接法) 优点：克服单酶切黏性末端连接法的缺点，能定向克隆。但实验操作烦琐。 同尾酶黏性末端间连接：产生杂合位点，不易酶切回收插入片段。但在制备载体DNA片段时不需除去限制酶就可进行连接，防止载体的自身环化。 构建基因组文库常使用同尾酶Sau3AI和BamHI 2、平头末端连接法(平头末端法) 缺点：①连接效率低； 底物浓度高、酶使用浓度高。加低浓度PEG可促进连接效率。②不易回收插入DNA片段；③双向插入；④多拷贝插入(高底物浓度)。 3、同聚物加尾连接法(同聚物加尾法、同聚物接尾法) 优点：①不易自身环化；②连接效率较高；③对DNA片段无特殊要求。 缺点：①操作繁琐； ②外源片段难以回收；③不能调控外源基因的阅读框架。 4、人工接头连接法(人工接头法) ①DNA连接子法(连接子法) 应注意：a、接受连接子的DNA片段必须是平头末端；b、厂商提供的连接子有磷酸化和非磷酸化两种形式，后者在使用前需要用T4噬菌体多核苷酸激酶处理；c、用相应的甲基化酶修饰目的DNA片段；d、连接子浓度高，以至连接效率高；e、连接自会串联连接，但没有影响。 优点：a、可任意组合；b、可调节外塬基因的阅读框架；c、连接效率高。 连接子(linker)：人工合成的含有一种或几种限制内切酶位点的平头末端双链DNA片段，8~12bp长。 ②DNA衔接头法(衔接头法) 衔接头(adaptor)：人工合成的一端为平头末端、另一端为某种限制内切酶的单链黏性末端的DNA片段。 第二节 重组DNA分子导入受体细胞 转化(transformation)是指将质粒载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程。 转染(transfection)是指将噬菌体载体或病毒载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程。 一、重组DNA向细菌细胞转入 1、感受态细胞热激转化法(化学转化法?) 感受态细胞是指处于能摄入外源 DNA的这种生理状态的细胞。 导入方式：42℃热激45~90s 转化效率：105~106转化子/μg 2、电击转化法(高压电穿孔法) 原理：将受体细胞置于一个适当的外加电场中，利用高压脉冲对细菌细胞的作用，使细胞表面形成暂时性的微孔，质粒DNA得以进入细胞质内，但细胞不会受到致命伤害，一旦脱离脉冲电场，被击穿的微孔即可复原。 影响因素：①电压大小(300~600V/cm)；②脉冲时间(20 ~100 ms)；③重组DNA量。 特点：操作简单，不需制备感受态细胞，适用于任何菌株。但需要昂贵的仪器设备。 转化效率：109~1010转化子/μg 二、外源DNA向真核细胞转入 1、载体介导外源DNA转移(载体介导基因转移) 病毒载体、质粒载体 2、外源DNA直接转移(基因直接转移) ①磷酸钙沉淀法(DNA/磷酸钙共沉淀法) 原理：DNA溶液与适量的CaCl2溶液混合，再加入一定量的磷酸盐溶液，逐步生成DNA-磷酸钙沉淀复合物。将适量的DNA-磷酸钙沉淀加入细胞培养液中，通过细胞的胞饮作用进入细胞质或进而转移到细胞核内，然后整合到染色体上，或游离于细胞质中逐渐被降解。 影响因素：a、沉淀中的DNA浓度，加受体DNA可提高转化效率；b、沉淀与细胞的保温时间。 ②脂质体介导法 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状脂质小泡结构，其大小一般为1~5um。