基因工程原理和技术-10.ppt

2、提高外源基因表达水平的策略 ①启动子的选择和改造； 组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子 人工杂合启动子 ②利用增强子序列； ③利用真核基因的翻译调控序列； 如：5’端Ω因子、 kozak序列、 3’端poly(A)信号序列、内含子等 ④利用定位信号序列； 如：内质网定位信号 KDEL的编码序列 ⑤叶绿体转化。 a、叶绿体DNA拷贝数多；b、具原核表达方式，可直接表达来自原核生物的基因；c、能以多顺反子的形式表达多个基因。 二、外源基因表达的检测 Northern杂交、RT-PCR、酶联免疫吸附分析(ELISA)、Western杂交、报告基因检测法。 1、gus基因的检测 底物：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc) 组织化学法、分光光度法、荧光法 2、NPT-II基因的检测 底物：[γ-32P]ATP 凝胶原位检测法、点渍法、层析法 3、荧光素酶基因的检测 底物：荧光素 荧光分光光度法、荧光显微镜法 4、胭脂碱和章鱼碱的检测 纸电泳分析法 菲醌(荧光染料)染色 5、cat基因的检测 底物：乙酰CoA、氯霉素 分光光度计法 6、pat基因的检测 PPT乙酰转移酶 底物：乙酰CoA、PPT 分光光度计法 三、外源基因的遗传特性 1、外源基因的遗传稳定性 一旦外源基因整合，就随植物基因组而稳定遗传。 但也会发生外源基因丢失。其原因是：①转基因植株是嵌合体；②减数分裂同源染色体对等交换；③有丝分裂的同源重组和基因重排；④外源基因整合在细胞器基因组中，在随后的细胞质分裂中丢失。 2、外源基因的遗传规律 孟德尔式遗传 单拷贝整合 多拷贝整合 * 第十章 植物基因工程 1983年，首次获得转基因植物——转基因烟草 现在，已获得200多种植物的转基因植株。 第一节 农杆菌及其转化体系 一、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciences)的生物学特征 1、形态 细胞呈杆状，大小为 0.8 um ×1.5~3.0um，1~4根周生鞭毛，菌落无色、光滑。 2、生长条件 最适温度：25~30℃，28℃培养；最适pH：6.0~9.0 3、宿主植物 双子叶植物、裸子植物 4、侵染宿主的症状及原因 冠瘿瘤，Ti质粒(tumor inducing plasmid)的T-DNA。 T-DNA是指农杆菌质粒上一段能转移并整合到植物染色体上的DNA片段。 二、Ti质粒的结构和功能 1、Ti质粒的类型与分区 环状双链 DNA分子， 140~235 kb。 根据其诱导植物细胞产生冠瘿碱的种类，分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型、农杆菌素碱型(琥珀碱型)。 功能区 毒性区(Vir区) T-DNA区 接合转移区 复制起始区 章鱼碱型 2、T-DNA的结构与功能 边界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC 右边界序列是完全保守的，对T-DNA转移是必须的。 T-DNA的编码基因 3、Vir区的结构与功能 30~40 kb，有virA~virM等操纵子。 virA操纵子：组成型，长约为2.8kb，virA基因。VirA蛋白(92kD)是内膜受体蛋白，感应并结合酚类化合物(乙酰丁香酮，AS)，是一种自激酶并使VirG蛋白磷酸化而被激活。 virG操纵子：组成型，1.0kb，virG基因。VirG蛋白(30kD)为转录激活因子，诱导其他vir基因的表达。 virB操纵子：诱导型，virB1~virB11基因。VirB蛋白构成跨膜复合体(T-链复合体运输器)供T-DNA越膜转移。 virC操纵子：诱导型，virC1、virC2基因。VirC1蛋白与超驱动序列(离右边界外侧17bp处的一个24bp的保守序列)结合，促进T-DNA加工。 virD操纵子：诱导型，virD1~virD4基因。 VirD1(16kD)、VirD2(47kD)蛋白参与T-DNA加工形成T-链：首先VirD1与25bp边界序列亲和结合，使其松弛，然后使V