双链DNA中的尿嘧啶核苷酸基板是一个课件.ppt

双链DNA中的尿嘧啶的底物的核苷酸 切口在人体细胞的修复途径 胞嘧啶：尿嘧啶的水解脱氨生成一个高度突变的DNA碱基病变被认为是一个主要的在活的有机体的自发突变的来源。 切口修复途径：这个新的修复功能的AP核酸内切酶在古细菌和人类进化上保守的，针对DNA修复一个可能的进化起源在一个共同的DNA自发损伤机制祖先的所有形式的生命。 自发水解脱氨的胞嘧啶 DNA 中的尿嘧啶（U） 是一个恒定的细胞中的基因组不稳定性的来源。这诱变过程在高温下和在单链DNA中极大的提高。如果不修复，这些尿嘧啶残基发生C→T的转换，这是最常见的自发突变,在生物体经常被发现在人类肿瘤 人类最主要的嘌呤/嘧啶（AP）的核酸内切酶，APE1，是一种脱氧尿苷核酸内切酶，可以删除在DNA糖基化酶独立的核苷酸尿嘧啶残基 APE1切割寡核苷酸含有一个单一的U?G碱基对的双链的活动。APE1具有高亲和力的DNA含有U但切割DNA在一个极低的速率双工的MALDI-TOF MS分析反应产物表明APE1催化裂解U?G双工产生预期的DNA片段5′末端脱氧尿苷酸。 经典DNA糖基化酶—发起的BER途径提出的理论问题高效的DNA损伤的修复，因为它会产生高度遗传毒性的中间体，如AP位点和/或堵塞3′末端必须消除了额外的步骤之前启动修复合成。 在我们的实验室工作，与其他观察，确定了一种经典的误码率，核苷酸切割修复（NIR）途径，其中一个AP核酸内切酶进行切口5′到受损的碱基在DNA糖基化酶独立的方式，导致在一个自由的3′-OH基团适用于DNA聚合酶和5′悬挂损坏的核苷酸17。近红外的核酸内切酶包括大肠埃希菌NFO，酿酒酵母APN1，和人APE1可以直接切割DNA双链在链中的α-端基异构2′-脱氧核苷（αDN）或各种氧化的嘧啶启动去除通过链置换合成耦合在5′-裂解的特异性核酸内切酶皮瓣。 APE1催化脱氧尿苷核酸内切酶活性。（一）时间和一种含有一个单一的尿嘧啶DNA裂解条件依赖性残留的APE1。3 - 10 nm′[32P]–标记的30聚体的U?G双工（杜RT序列上下文）孵育15–180分钟在37°C与10 nm APE1下近红外和误码率的条件。1车道，控制你?G；2车道，但孵育140 nm和10 nm APE1 hTDG BER + Mg2 +的反应条件下。3–14车道，1但APE1孵育的BER + Mg2 +或近红外条件下。（b）各种NIR核酸内切酶和ape1-d308a突变作用向你?G双工。3 - 10 nm′[32P]–标记的30聚体的U?G，和α大?T寡核苷酸的双链（杜RT序列上下文）孵育10 nm的野生型（WT）APE1和10 nm ape1-d308a NIR下2小时或在各自的NFO和APN1数量有限的条件在37°C.箭头表示的位置为30分钟的反应缓冲液的noncleaved 31肽底物，的21聚体ape1-nir位置产品，和20个碱基的DNA糖基化酶产品的位置。 一种用于识别的寡核苷酸的近红外活性和相对单碱基损伤序列APE1效率的催化双链DNA底物裂解 1 dU-RT d(TGACTGCATAUGCATGTAGACGATGTGCAT) 11 8.5 2 dU-RT-GUG d(TGACTGCATGUGCATGTAGACGATGTGCAT) 11 11.7 3 dU22 d(CACTTCGGAUTGTGACTGATCC) 10 5.8 4 dU-DL10 d(AATTGCTATUTAGCTCCGCACGCTGGTACCCATCTCATGA) 10 11 5 dU-PP d(CATCTCATGAAATTGCTATUTAGCTCCGCACGCTGGTACC) 20 7.2 6 dU-PS d(AGCTACCATGCCTGCACGAAUTAAGCAATTCGTAATCATGGTCAT) 21 2 7 dU-DL d(AATTGCTATCTAGCTCCGCUCGCTGGTACCCATCTCATGA) 20 0 8 dU-DL-CUG d(AATTGCTATCTAGCTCCGCUGGCTGGTACCCATCTCATGA) 20 1.5 9 dU-RT20 d(GGCTGCATAUGCATGTAGCC) 10 4.9 10 dU-RT17 d(GGTGCATAUGCATGTCC) 9 7.8 11 dU-RT15 d(GGGCATAUGCATGCC) 8 0 12 dU-RT13 d(GGCATAUGCATCC) 7 2 13 dU-RT11 d(GGATAUGCACC) 6 1 14 dU-RT9 d(GGTAUGCCC) 5 1.5 15 dU-RT20-AUA d(GGCTGCATAUACATGTAGCC) 10 9.3