毕业设计黄芩苷抗金黄色葡萄球菌溶血素作用机制的确证课件.ppt

黄芩苷抗金黄色葡萄球菌α-溶血素作用机制的确证 指导教师：陈志宝 班 级：生物技术 姓 名：周薇 学 号：20094081129 简介 材料与方法 菌株及载体：金黄色葡萄球菌8325-4 大肠杆菌DH5α、BL21 主要试剂：PBS缓冲液 Amp 贮液 IPTG 贮液 离子交换缓冲液（Buffer A） 离子交换缓冲液（Buffer B） 5 mM脱氧胆酸钠溶液 仪器：普通PCR扩增仪 电泳系统 凝胶成像分析系统 超声波细胞破碎仪 Akta purifier 恒温水浴锅 超净工作台 生化培养箱 恒温摇床 紫外分光光度计 制冰机 高速离心机 材料与方法 方法： 1 hla及hla突变体的引物设计 2 基因组提取 3 hla-pGEX-6P-1载体的构建和原核表达 4 QuikChange法对hla基因进行定点突变 5 Hla重组蛋白和突变蛋白的大量表达和纯化 6 荧光淬灭试验 7 SDS观察黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla寡聚体形成的影响 8 溶血试验 结果 1 hla-pGEX-6P-1载体的构建和原核表达 1.1 金黄色葡萄球菌hla基因的克隆及序列分析 1.2 重组Hla的可溶性分析 1 PCR扩增得到的hla基因电泳图 2 菌落PCR鉴定电泳图 3 重组载体双酶切鉴定电泳图 结果 4不同温度诱导时Hla的表达情况 5 不同温度诱导下Hla的表达形式 结果 2.2 uiQkChange法对hla基因进行定点突变 结果 2.3 重组Hla蛋白和突变Hla蛋白的纯化 结果 2.4 Hla与黄芩苷结合常数 结果 2.5 SDS观察黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla寡聚体形成的影响 结论 1 通过定点残基突变试验，表达和纯化了野生型Hla和突变体Hla（Y148A、P151A和F153A）； 2 通过荧光淬灭试验，测定了黄芩苷与野生型Hla及三种突变体Hla（Y148A、P151A和F153A）的结合常数。结果表明，黄芩苷与三种蛋白结合力大小顺序为：野生型 F153A P151A Y148A，与我们在第二章中理论模拟的结果一致； 3 通过脱氧胆酸诱导的Hla寡聚化试验考察了黄芩苷对Hla七聚体形成的影响，结果表明黄芩苷剂量依赖性地阻碍Hla七聚体的形成；此外，还比较了相同浓度的黄芩苷、汉黄芩苷及野黄芩苷对Hla七聚体形成的影响，结果显示其抑制能力的大小为：黄芩苷 汉黄芩苷 野黄芩苷，与第二章模拟的结果一致； 4 通过纯化Hla溶血试验比较了黄芩苷、汉黄芩苷和野黄芩苷对Hla溶血活性的影响，黄芩苷抗Hla的IC50为6.63μg/ml，汉黄芩苷则为10.27 μg/ml，而野黄芩苷对Hla的溶血活性几乎没有抑制作用。 * 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus,（简称为金葡菌）是常见的革兰氏阳性致病菌，是极其重要的人兽共患病原体。 1 2 本研究应用定点残基突变和荧光淬灭试验验证黄芩苷与α-溶血素的结合位点。通过将α-溶血素氨基酸序列中的Tyr148、Pro151和Phe153突变为丙氨酸（Ala），表达和纯化野生型α-溶血素及突变体α-溶血素，应用荧光淬灭试验测定结合常数，结果表明，突变后的α-溶血素与黄芩苷的结合明显降低，结合常数大小为野生型 F153A P151A Y148A。通过脱氧胆酸诱导的寡聚化和SDS验证了黄芩苷对α-溶血素七聚体形成的影响。 6野生型hla基因序列和突变型hla序列 7亲和层析收集蛋白电泳图 8 Hla在Resource S离子交换柱上的色谱图 9 Resource S离子交换后Hla电泳图 10 Hla在Superdex 75柱的色谱图 11 过Superdex 75柱后Hla电泳图 12 黄芩苷与野生型Hla和两种突变体Hla相互作用的荧光光谱 13 黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla 寡聚体形成影响 14 黄芩苷、汉黄芩苷和野黄芩苷阻碍Hla七 聚体形成能力的比较 在论文付梓之际，我在此向各位关心﹑帮助﹑支持我的老师同学和朋友致以最真挚的谢意！是他们的支持和辛劳才使我顺利完成多年的学业！谢谢！