基因操作主要技术原理.ppt

32p 1 5 10 ﹡ 1 4 8 10 ﹡ 加入蛋白质X 加入DNaseI凝胶电泳放射自显影 1 5 10 A B 足迹 (a) (c) (b) DNaseI 足迹实验 如果使用较大的DNA片段,通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样,我们也可以加入非标记的竞争DNA序列,来消除特定的“足迹”,并据此测定其核苷酸序列的特异性。 硫酸二甲酯(DMS)足迹实验: DMS能使裸露的鸟嘌呤(G)残基甲基化,而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。 而与蛋白结合的DNA片断上的G残基,不会被DMS甲基化,从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片断的序列中,不存在具这些G残基末端的DNA片断,出现了空白区。 甲基化干扰实验(methyltion interference assay) 根据DMS(硫酸二甲酯)能够使G残基甲基化,而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理,设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法,即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应,从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。 DMS化学干扰的主要局限性是,它只能使G残基甲基化。尽管如此,它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段,可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 具体操作如下页图所示。 G G G G G G m Ⅰ G G G Ⅲ m G G G m Ⅱ G G G m Ⅱ G G G m Ⅰ G G G Ⅲ m DNA 局部甲基化 与蛋白质提取物混合 与蛋白质结合 不与蛋白质结合 与蛋白质结合 凝胶电泳 与蛋白质结合的DNA带含有Ⅰ和Ⅲ两种类型DNA片段 不能与蛋白质结合的DNA带含有全部三种类型DNA片段 切除所有结合与不结合蛋白质的DNA带，并用六氢吡啶切割甲基化的G残基 结合带 非结合带 缺失的DNA带表明相应G残基的重要意义，它得到结合蛋白质的保护 甲基化干扰实验 4、体内足迹实验 G G × G G × me G G G G Me Me 完整的细胞 裸露的DNA DMS 硫酸二甲酯 分离DNA并用六氢吡啶切割 凝胶分析 PCR扩增 受保护的G残基 应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验 DNA核苷酸序列分析 传统的DNA序列分析法: Sanger双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert化学分析法 新发展的DNA杂交测序法 Sanger双脱氧链终止法原理: 双脱氧链终止法要求使用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物。 利用DNA聚合酶的两种酶催化反应的特性:第一,DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板,合成出准确的DNA互补链;第二,DNA聚合酶能够利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物,使之参入到寡核苷酸链的3’-末端,从而终止DNA链的延长。 公元11年（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） (西汉王莽新朝三年)，是中国古老的实证医学萌芽。由于儒、释、道三教合流所形成的中国文化格局，“重道轻器” （45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）衍生出的务虚倾向，重体悟而疏实证，必然缺少逻辑推理，致使中国的实证医学成就在日后难以与西方医学同日而语。古埃及医师运用念咒、画符和草药治病，前二者就是巫医。（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）西医在古希腊时期就开始医巫分家，亚里士多德曾详细描述了动物的内脏和器官，古希腊医学最高成就的代表人物希波克拉底将唯物主义哲学运用于医学之中，在《论圣病》中说：“被人们称为‘神圣的’疾病(指癫痫和一些精神患者)，在我看来一点也不比其他病症更神、更圣，与其他任何疾病一样起源于自然的原因。只因这些病症状奇异，而人们对它们又一无所知，充满疑惑，故而将其原因和性质归之于神灵。”亚里士多德所创立的唯物主义医学体系，加快了医学科学化的进程；（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） （df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2） ……非凡（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）的事件都集中发生在这个时期。……并且是独立地发生在中国、印度和西方”。这一阶段，（