第3篇 细胞工程10.ppt

* PEG介导的细胞融合： （1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。 （2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。 （3）30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全培养液，终止PEG作用。 （4）离心，弃上清，用20％小牛血清等轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。 * 融合后细胞悬液加入96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。 * * * 单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。 单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下： 1．诊断各类病原体这是单克隆抗体应用最多的领域，已有大量的商品诊断试剂供选择。如用于诊断乙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物感染的试剂等。单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点。尤其在鉴别菌种型及亚型、病毒的变异株以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。 2．肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单克隆抗体，但对肿瘤相关抗原（例如甲胎蛋白和癌胚抗原）的单克隆抗体早已用于临床检验。 近年来，有人利用单克隆抗体进行肿瘤分型，对制定治疗方案和判断预后也有帮助。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单克隆抗体主要用于体内诊断，结合X线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定位诊断。 3．检测淋巴细胞的表面标志用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。例如检测CD系列标志，有助于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，对多种疾病诊断具有参考意义。对细胞表面抗原的检查在白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面也有指导作用。组织相容性抗原是移植免疫学的重要内容，而应用单克隆抗体对HLA进行位点检查与配型可得到更可信的结果。 4．机体微量成分的测定应用单克隆抗体和免疫学技术，可对机体的多种微量成分进行测定，如诸多酶类、激素、维生素、药物等；对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和治疗均具有实际意义。 上述应用的单克隆抗体属于鼠源性，作为体外诊断试剂是满意的。鼠源单克隆抗体如作为生物制剂应用于人体，则因是异性蛋白可引起过敏反应甚至危及生命。从临床治疗及预防疾病的要求，希望制备出人源性单克隆抗体。目前虽然已有文献报道，通过人－鼠细胞杂交及人－人细胞杂交进行了一些探索，但对这些细胞株培养很不稳定，融合细胞中人的染色体往往呈选择性丢失，以致细胞株难以维持培养。因此制备人源单克隆抗体是目前急待解决的问题。 吊兰，它能在每个嫩芽处都可长出一个新个体，这就是最自然的“克隆”现象。 自然界许多植物可以通过插条来实现个体繁殖。 ——无心插柳柳成荫 与植物细胞不同，一直以来认为在动物发育过程中分化了的细胞一般不能再产生完整的充分分化的个体。 尚未分化的胚胎细胞具有全能性。基于这种认识，人们采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技术成功克隆出了许多动物。 * 1960年代初鱼类核移植工作在由中国实验胚胎学家童第周最早开展。他将一种鱼的细胞核移植到另一种鱼的去核卵中。不同属甚至不同亚科的核质重组可产生能生育的成年鱼。与原种相比，属间杂种鱼表现生长速度快、蛋白含量高及低脂肪等特点，说明克隆技术可生产具有商业价值的优质鱼。 1983年，美国 JamesMcGrath 和 DavorSolter 于引入细胞融合法，以小鼠受精卵为供体克隆小鼠。 1986年，英国 SteenWilladsen 引入电融合，这种方法比传统的病毒或化学介导融合法更方便、安全。他用绵羊的8细胞胚胎作供体进行核移植，获得克隆羊。 1987年，美国 JimM.Robl 等获得胚胎克隆牛。 * 1996-1997年成功制造首只体细胞克隆动物“多莉”羊的成功证明了成熟的体细胞也具有全能性。 “多莉”的诞生，既说明了体细胞的遗传全能性，也翻开了人类以体细胞核竞相克隆哺乳动物的新篇章。此项技术因而荣登《Science》周刊评出的1997 年十大科学发现的榜首。 核供体动物的选择与供体细胞的获得。 核受体动物的选择与细胞核的移出。 供体细胞与去除细胞核的受体细胞的融合。 胚泡的体外试管培养。 代母的选择与胚泡移入子宫。 克隆动物的体内发育与出生