第十二篇DNA RNA 蛋白质.ppt

第十二章DNA、RNA和蛋白质;DNA的基本操作：DNA（线状双链DNA）、ocDNA（开环双链DNA）、cccDNA（闭环双链DNA）。 DNA是相当稳定的，但是使用时也不能太随意，DNA的污染来源主要是其他DNA分子。 DNA保存： DNA在中性PH，低温，暗处，合适的盐浓度和无物理剪切的条件下较稳定 ，适宜保存。用于存放DNA的缓冲液有三种,TE，0.1×TE(适宜酶促反应)，T50E （适宜溶解PH不稳定的DNA）。 DNA检测： 1.紫外吸收 2.溴化乙锭（EBa） DNA浓缩： 1. DNA不溶于乙醇，所以一般用乙醇沉淀DNA来达到纯化的目的; 2.异丙醇沉淀； 3.有机溶剂浓缩DNA，如正丁醇。 DNA纯化： 1. 酚抽提（适宜样品DNA中混有蛋白质污染）；2.苯酚/氯仿/异戊醇抽提; 3.DEAE/纤维素交换树脂(其他杂质); 4.凝胶过滤(适宜除去样品中含有盐、缓冲液组分、小分子杂质等)。;1. DNA的分离： ;2. DNA的转化;3.DNA的扩增：主要是PCR技术;4.DNA的重组：指将目的基因从这一载体插入到另一载体的过程。;DNA重组过程中的注意点：;RNA篇;RNase无处不在。 细胞内存在大量的RNase，裂解细胞时应特别注意。 人的体液中含有大量的RNase，应尽量避免样品和样品管与体液的接触，养成戴手套和口罩的习惯，勤更换。 空气中的灰尘和细菌中含有大量的RNase，应建立干净的操作环境。;防止RNA酶污染一、防止RNA酶污染 的措施 1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。;二、常用的RNA酶抑制剂 1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂，他通过和RNA酶的活性基因团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 2.异硫氰酸胍 ：它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合 形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin ）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。;RNA的分离;测定 与 的值，根据二者的比值来估计制备样品的纯度，纯净的DNA比值为1.8，纯净的RNA比值为2.0，比值过大过过小则说明样品中含有蛋白质杂质，需去除。; 首先，必须了解待纯化样品中目的蛋白及主要杂质的性质，尽可能多的收集有关蛋白质来源、性质和稳定性等信息，有助于设计蛋白质纯化方案。 其次，纯化开始前必须了解最终产品的用途，要综合考虑纯化产品的质量、数量和经济性等三方面的要求。 最后，充分了解各分离纯化技术操作单元的大量信息也很重要。;主要操作过程;细胞的破碎; 化学及生物化学法： 酶溶法：利用各种水解酶，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。特点： a) 此法适用多种微生物； b) 具有作用条件温和； c) 内含物成分不易受到破坏； d) 细胞壁损坏的程度可以控制。 化学渗透法：某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。特点：多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。 存在的问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较强；通用性差。;蛋白质样品的分离;蛋白质浓缩法;吸附法 原理：将干的惰性多孔基质聚合物，如葡聚糖凝胶，加入到蛋白质溶液中吸收水和其他小分子，当凝胶完全膨胀后，没用过滤或离心方法去除凝胶，分离出蛋白质。 优缺点：简单快速，仪器简单，适应于稳定性较差的蛋白质。但选择性比较差，不能连续操作，浓缩倍数较低，蛋白质回收率低，仅有80%~90%。 ;;透析：是指溶质从半透膜的一侧透过膜至另一侧的过程。 任何天然的(如腹膜)或人造的