第二节 基因工程制药 新版2.ppt

（B） 改造酶切位点 野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个。 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。 （C） 增加选择标记 加装选择标记 lacZ （5）λ噬菌体载体的使用 重组λDNA的构建 (酶切，连接） λ噬菌体的体外包装 λ噬菌体侵染大肠杆菌 重组λDNA的分离 （6）λ噬菌体载体的优点 容量大，装载能力可达23kb，便于构建基因文库 重组子筛选较为方便 DNA提取操作较为简便 4：单链DNA噬菌体M13载体 M13噬菌体（M13 phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，遗传物质是环状单链DNA,全长约6.5kb。宿主是丝状大肠杆菌。它是单链DNA噬菌体中的一个典型的代表。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。 噬菌体M13感染宿主之后，在含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的X-gal培养基中生长时，会形成蓝色噬斑。通过蓝色噬斑的出现可以显示噬菌体M13的存在。 感染宿主之后，噬菌体M13所释放的单链DNA可用于制作放射性标记探针，用来检测RNA的结构。 M13噬菌体的组成和结构 M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。 M13噬菌体的外型呈丝状 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 DNA全长6407个核苷酸 M13 DNA上至少有11个基因 2700个外壳蛋白分子 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 M13噬菌体的组成和结构 单链DNA，由6407碱基组成。 90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因 基因间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ/Ⅲ以及基因Ⅱ/Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。 M13噬菌体的基因组 M13噬菌体的基因组 编码3类蛋白质： ①复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ） ②形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ） ③结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ） M13噬菌体载体的构建 M13噬菌体作为载体的重要特点： ①M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢； ②M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中； ③M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。 ⑤M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。 ⑥外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp间隔区----M13不像λ噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之间）。 5：人工质粒载体--科斯质粒 1978年Collins和Hohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid(柯斯质粒)，又叫粘粒。 柯斯质粒（cosmid）= cos序列+质粒。 实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同λ噬菌体的cos位点构成。 [A]、科斯质粒的基本组成 [B]、科斯质粒的特性 [C]、科斯质粒的用途 Cos质粒（考斯质粒 Cosmid） [A]、科斯质粒的基本组成 （1）含有λ噬菌体DNA的粘性末端序列（COS序列）。 （2）含有质粒的一个复制起始区。 （3）含有质粒的一个抗药性标记。 （4）具有多种限制性内切酶的单一性切点。 柯斯质粒pHC79系 由质粒pBR322和λ噬菌体的cos位点的一段DNA构成。 包装时，cos位点打开而产生λ噬菌体的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。 凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似λ噬菌体的颗粒。 因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象λ噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。 [B]、科斯质粒的特性 （1）分子量较小，由4 kb-6 kb组成，装载量大（可达45kb) 。 （2）重组之后能象λ-DNA一样体外包装，并高 效导入受体细胞。 （3）进入宿主细胞之后能够进行复制扩增。可 象质粒在大肠杆菌内复制，（在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑）不裂解细胞。 （4）由于携带质粒的选择标记，便于筛选 [C]、科斯质粒的用途 常用的粘性粒有PHC