上海交通大学医学院免疫学和免疫学检验课件第二十四讲 免疫学技术.ppt

体外抗原抗体反应 高度特异性 高度特异性例外 交叉反应 直接凝集反应 单向扩散试验 梅花孔可确定Ab效价 对流免疫电泳 免疫电泳 火箭电泳 2.外周血单个核细胞分离 2000rpm 20 min 血浆 单个核细胞 淋巴细胞分离液 红细胞、粒细胞 1.077 1.093 1.075 密度梯度离心：聚蔗糖-泛影葡胺分层液（Ficoll) 连续密度梯度离心： PVP包被的硅胶混悬液（Percoll） 抗凝全血 死细胞、血小板层 单核细胞层 淋巴细胞层 红细胞、粒细胞 3.淋巴细胞与单核巨噬细胞的分离 利用吞噬和粘附功能 粘附法：玻璃或塑料培养瓶或平皿，玻璃纤维柱 磁铁吸附法：羰基铁粉吞噬或粘附 羰基铁粉-乳胶微粒分层分离法： 吞噬后用Ficoll分离 葡聚糖凝胶过滤法：G10粘附 + 洗脱 4. T、B淋巴细胞分离 E花环沉降法： E受体 + E E花环 尼龙毛分离法：尼龙纤维柱 粘附 B 5. 淋巴细胞亚群分离 利用抗表面标志的单抗 亲和板结合分离法 补体细胞毒法 FACs法 MACs法 塑料培养板结合二抗 ＋ （细胞 ＋ 单抗） 细胞 ＋ 抗体 ＋ 补体 细胞 ＋ 荧光素标记单抗 仪器分选 磁珠交联单抗（或二抗） ＋ 细胞 强磁场分离 Figure A-26 6. 巨噬细胞分离 Percoll密度梯度离心法 粘附贴壁法 斑蟊敷贴法 7. 树突状细胞分离 单个核细胞 塑料板黏附法 M?、B、DC DC失去黏附能力 继续培养过夜 Ab包被的SRBC吸附M? 、B细胞 (Fc受体) DC 外周血单个核细胞 体外培养 GM-CSF、IL-2 DC 8. NK细胞分离 Percoll密度梯度离心法 利用表面标志分离 二. 免疫细胞的体外培养 培养液 温度 CO2 湿度 培养基 RPMI 1640常用 血清 小牛、胎牛、人AB血清等， 56℃ 30min灭活 添加成分 易失效成分：谷氨酰胺 缓冲成分： Hepes 抗菌素：青、链、氨苄青、庆大 其它：NaHCO3、葡萄糖、丙酮酸钠等 37℃ 5% 无菌操作： 超净台、煤气灯 1. 短时保存：室温或4℃， 注意避免温度休克 长期保存：-80℃ 冰箱或 -196℃ 液氮， 用冻存液配成细胞悬液 3. T、B细胞转化建系培养： 永生化生长 B： EB病毒（用B958细胞株制备）转化形成LCL ( Lymphoblastoid cell line ) T： HTLV-1转化 4. T细胞短期扩增培养和克隆化培养 刺激 混合淋巴细胞培养 丝裂原（PHA、ConA） 抗TCR或CD3抗体 特异性抗原 + APC 非特异性 T活化增殖 促生长因子 饲养细胞 IL-2、巯基乙醇 细胞生长的密度依赖性 PBMC、脾细胞、EB转化B细胞 经放射或丝裂霉素处理 重复刺激技术： 刺激4d，休息10d，再刺激4d 细胞克隆化分离技术： 有限稀释法 显微操作法 软琼脂克隆法 FACs分选法 三. 免疫细胞亚群分析及表面分子检测 1.意义 各亚群的比例可部分地代表免疫状态 某些表面抗原的出现与否与特定的功能或状态有关 如 T数量、CD4/CD8、Th1/Th2 如：CD44及其变异体的表达与肿瘤细胞 的转移能力 B7的缺乏与肿瘤逃避免疫监视 2.检测亚群的依据： 表面标志 功能：如Th1/Th2分泌不同的细胞因子 mRNA： 如?? T / ?? T 3. 检测方法 花环试验 E花环： T-CD2 绵羊红细胞 EAC花环：B-CR 结合有补体的牛红细胞 免疫荧光法 直接 间接 荧光显微镜 FACs 免疫细胞化学 HRP AP ABC法 APAAP法 细胞涂片，显微镜观察 mRNA半定量：RT-PCR T:表达CD2(SRBC受体） B:不表达CD2 免疫放射分析（IRMA） 单位点 双位点 过量Ab* + 待测Ag Ab*Ag + Ab* 免疫吸附剂除去游离Ab*，测上清的放射强度 Ab 待测Ag Ab* 八. 酶免疫技术 1. 酶和底物 辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶(AP) ?-半乳糖苷酶(?-Gal) 葡萄糖氧化酶(GO) 苹果酸脱氢酶(MDH) DH2 + H2O2 D + H2O 邻苯二胺(OPD) 四甲基联苯胺(TMB) ABTS、5-ASA NPP + H2O NP + H3PO4 对硝基苯磷酸脂（NPP） 2. 酶的标记 直接结合法 交联法 抗体与酶直接结合 过碘酸钠法 双功能交联剂为桥联结酶与抗体 戊二醛法、苯二马来酰亚胺法、 马来酰亚胺衍生的琥珀酰亚胺脂法 用透析法或沉淀法分离去除交联剂， 用SephadexG-