组织胞浆菌病课件.ppt

南方医科大学珠江医院临床医学检验中心 暨临床免疫研究中心实验室 胡冬梅 2009年3月10日 General condition of the Paper Title：Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. Author：Nosanchuk JD, Steenbergen JN, Shi L, Deepe GS Jr, Casadevall A. Periodical：J Clin Invest. Data：2003, 112(8); 1164-75 SCI Index：16.915 Content Background 1. 荚膜组织孢浆菌（Histoplasma capsulatum，Hc）是真菌呼吸道疾病的最主要的原因； 2. 免疫缺陷患者的发病率高，病情严重，死亡率高； 3. 抗真菌治疗效果有限； 4. 目前的共识：体液免疫在宿主抵 抗HC中的作用有限或缺如； 5. 研究的假设：单克隆抗体具有抗 HC的作用。 Thread Method Method Methods 单抗功能测定 Methods 1. 单抗对HC的直接效应； 2. 单抗对HC的调理素样作 用对真菌的穿透性研究； 3. CFU的测定和小鼠生存 情况的研究： 4. 细胞因子和趋化因子的 测定： 5. 吞噬作用分析： 6. 巨噬细胞内酵母生长情 况分析：CFU测定 Methods 1. 单抗对HC的直接效应 Methods 2.单抗对HC调理素作用穿透真菌的研究 Methods 3. CFU测定和存活研究 Methods 4.细胞因子和趋化因子的测定 Methods 5. 吞噬作用分析 （1） 5. 吞噬作用（2）-受体的分析 LFA1(CD18/CD11a)、CR1(CD35), CD3(CD18/CD11b), CR4(CD18/CD11c) 转染 CHO细胞系 Methods 5. 吞噬作用分析 （3） Methods 6.酵母生长情况测定:检测细胞内HC酵母的生长是否受到保护性抗体调理素的影响 Methods Methods 制备HC细胞壁和细胞膜蛋白→SDS凝胶电泳→转膜→封闭→+单抗→ GAM IgM-HRP共孵育→显影摄片 纯化制备物→蛋白原位消化→质谱分析蛋白质分子结构→ BLAST序列检索→对编码蛋白的假想基因从HC进行扩增（将酵母细胞打断→制备HC RNA → RT-PCR） →克隆至大肠杆菌→裂解细胞→ 转膜→封闭→与C57BL/6 鼠的HC感染血清共孵育→ TBST洗涤→与GAM IgM/IgG-HRP共孵育→显影摄片。 Methods 备注： 在蛋白印迹分析前，用N-糖苷酶、高碘酸钠、或蛋白酶K对样本进行处理，以决定是否制备物的免疫活性成分是碳水化合物还是蛋白质。 Result Result Result Result Result Result Result Result Result Result HC免疫小鼠可以产生单抗，并与HC表面结合； 在HC感染前给予单抗，可以降低真菌的负荷，降低肺部炎症反应，延长感染小鼠模型的生命。 单抗的保护性调节作用与感染小鼠肺部IL-4, IL-6, 和 IFN-γ的提高有关。 通过CR3依赖型过程，单抗可以提高J774.16细胞对酵母的吞噬作用。 在HC单抗的调理素作用下，巨噬细胞样细胞J774.16对与酵母细胞的摄入与其生长抑制和杀伤有关。 单抗与HC表面表达的一种17-kDa抗原相结合，这种抗原被鉴定为组蛋白H2B样蛋白。 Conclusion 单抗与HC表面蛋白结合，改变了细胞内真菌的命运，介导了小鼠模型对致命性组织胞浆菌病保护性反应，提示它可能是发展疫苗的一种候选抗原。 The protein sequence is compared with that of histone H2B sequences reported in other fungi. 小 结 Culture of Histoplasma capsulatum 结论：Conclusion 背景：Background 思路：Thread 结果：Result 方法：Method Histoplasma capsulatum 单抗针对性抗原的产生与鉴定 单抗特性及功能 单抗的位点分析 单抗的传代和鉴定