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血友病研究的进展安徽省立医院血液科 吴竞生 血友病是由于遗传性凝血因子VIII（FVIII）和IX（FIX）基因缺陷，造成血浆FVIII和FIX含量不足或功能缺陷，引起的一组终生出血的凝血障碍性疾病，包括血友病A（FVIII缺乏）和血友病B（FIX缺乏），属X性联隐性遗传疾病。 西方国家血友病患病率为5-10/10万人口， 我国2.73/10万人口。 血友病治疗进展 70年代-有效替代治疗，致残率与死亡率? ?，寿命由平均10岁??接近正常。 80年代-病毒灭活技术改进，替代治疗安全性?，感染病毒性肝炎，爱滋病? ?。 90年代-重组凝血因子广泛应用，提高疗效；避免抗体产生与易发生病毒感染的副作用。基因治疗在动物试验中获得成功,在人类的临床初步研究成果为血友病的根治带来曙光。 如何进一步降低血友病患者的死亡率，致残率，出生率，提高患者生存质量是目前工作的重要任务。 一．发病机制的研究 FVIII基因定位于Xq28，全长186kb，由26个外显子和25个内含子组成。已发现约300多种基因突变，基因型与表型密切相关。点突变，小的基因缺失引起轻度FVIII缺乏。终止密码子，大的基因缺失，插入，移位，无义突变往往引起严重的FVIII缺乏和临床表型。FVIII 22内含子倒位突变引起FVIII严重缺乏是45%的重型血友病A的分子发病机制。最近在1%的重型血友病A中还发现FVIII内含子1倒位突变。 二．基因诊断 （一）直接基因诊断： 确定致病基因；携带者检出和产前诊断。 采用PCR，DGGE，SSCP，DNA测序等方法直接测定致病基因的缺陷。FVIII 22内含子倒位分析可作为重型HA的筛选试验，是目前唯一用于临床诊断的直接基因检测方法。 FVIII 22内含子倒位和其它一些基因突变常伴有抑制物发生，因此有助于预测抑制物的产生。 （二）间接基因诊断 利用致病基因内外的限制性片段长度多态性（RFLP）作为特异分子遗传标志物，通过家系成员间的连锁关系确定血友病基因的遗传情况，进行DNA多态性分析的遗传学诊断(RFLP，VNTR，STR等方法)，联合多个RFLP，诊断率达可达99%。 RFLP分析的局限性：须具有先证者的标本；母亲系该多态位点的杂合子，联合多个RFLP。 （三）高危胎儿产前诊断 妊9-12周：绒毛膜活检获取胎儿DNA 。 妊12-16周：养水穿刺。 胚胎植入前：早期胚胎（8个细胞），通过DNA基因型和遗传表型确定胎儿性别，是否为血友病或携带者。 妊18-20周：胎儿镜下取脐静脉血，测定VIII:C/FVIII:Ag。流产危险（约0.5%-1%）。 早期，无创性产前诊断：FACS测定母体静脉血中的胎儿特异性单克隆抗体以确定胎儿性别。 三．替代治疗 目前最有效的治疗手段。主张尽早治疗，将凝血因子提高到止血水平，避免出血并发征，防止功能丧失。 （一）人FVIII浓缩物：近15年随着病毒灭活技术的改进（干热法-HIV?，有机溶剂加表面活性剂方法-HCV?，二步病毒灭活法-HAV?），血浆筛选的规范化（PCR），血制品的安全性大大提高，血源传播性疾病如肝炎，爱滋病发生率明显降低。 FVIII浓缩物 中纯度：含FVIII 1-3U/mg，每1U/kg可使血浆FVIII水平提高2%，含VWF，也可用于VWD。体内半寿期为8-12小时。副作用：病毒感染，抗FVIII抑制物产生。 高浓度：含FVIII 50-200U/mg，利用层析技术制备，不含VWF。 超高纯度：含FVIII 3000U/mg，利用离子交换层析或单克隆抗体技术制备，不含VWF， 用于FVIII抑制物 (中高滴度, 10-30BU) 的治疗。 （二）重组FVIII浓缩物（rFVIII） 基因克隆技术表达，生物活性，半寿期与血浆FVIII相似，安全，无病毒污染。价格昂贵，也可产生抗体。加拿大与爱尔兰几乎所有HA，美国70%重型HA采用。主要用于重型血友病A和抑制物的治疗。 第一代（全长FVIII）：人体白蛋白为稳定剂。 第二代（BDD）：蔗糖为稳定剂，FVIII无B区，但仍保留其活性，无免疫活性，更安全，有效。 第三代：鼠单抗，不含人和动物蛋白。 转基因方法生产的人血浆制品的产量将大幅度提高，有望满足全世界血友病患者的需要。 （三）猪FVIII浓缩物 抑制物对猪FⅧ的亲和性比对人FⅧ亲和性差，不易与人FⅧ抗体发生交叉反应,，用于高反应型抑制物且严重出血患者的治疗。约30%产生抗猪FⅧ抗体