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饲料用色氨酸表达菌株构建 　　L-色氨酸是继蛋氨酸、赖氨酸之后的第三代饲料添加剂，对于人和动物的生长发育及其新陈代谢都有着重要的意义，其使用效果是赖氨酸的3～4倍，具有十分广泛的应用前景，在医药、化妆、食品、保健品等行业也得到广泛的应用，国内国际市场对色氨酸的需求量也在不断增加。传统的化学合成法和酶法转化等方法的工艺成本又居高不下，这些原因的存在导致色氨酸在我国的应用受到限制。近年来，微生物发酵法生产色氨酸因原料来源十分广泛易得、适宜大规模投产而成为研究热点。本研究根据色氨酸在大肠杆菌中的合成途径，构建工程菌株过量表达催化色氨酸合成的前体物质3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮-7-磷酸（DAHP）的酶（aroG）和色氨酸合成酶（trpBA），通过aroG和trpBA的表达，增加色氨酸合成所需前体物质的产生，减少由反应产物对色氨酸合成酶的反馈抑制，从而增加色氨酸的产量。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　表达载体pET-32a为本实验室保存；dNTP，TaqDNA多聚酶及反应缓冲液，限制性内切酶EcoRI、XhoLI、λDNA/HindIII，MarkerIII，TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶均购自Takara；PCR试剂：dNTPs，PCR缓冲液购自Takara公司：低熔点琼脂糖，溶菌酶，购自Sigma公司；琼脂糖购自GIBCO公司；酵母提取物和胰蛋白胨为OXOID公司产品，氨苄青霉素(Amp)100mg/L，其它试剂均为国产分析。 　　1.2方法 　　1.2.1 引物的设计与合成 　　根据ncbi公布的aroG和trpBA基因序列设计引物，并且在两端加入合适的酶切位点EcoRⅠ、BamHⅠ和保护碱基。 　　1.2.2PCR扩增 　　以JMl09基因组为模板，分别以P1、P2和P3、P4为引物，扩增aroG和trpBA基因。反应体系：总DNA模板2μl；引物1(10μmol/L)1μl；引物2(10μmol/L)1μl；dNTPs(2.5mmol/L)2μl；5×Buffer5μl；Taq0.5μl；dH2O25μl；总体积25μl。反应条件：94℃10min；94℃1min、53℃1min、30个循环；72℃1min、72℃10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 　　1.2.3重组质粒的构建 　　将PCR产物用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切，经纯化回收后与经同样限制酶消化的表达载体pET-32a连接，转化至E.coliDH5α，经电泳、酶切和SDS(聚丙烯酰胺凝胶电泳)筛选鉴定重组质粒pET-32a-aroG，pET32a-trpBA，DNA测序鉴定。所用实验方法均按??试剂盒要求和分子克隆实验指南（第三版）进行操作。 　　1.2.4aroG和trpBA的诱导表达 　　挑取含表达重组质粒pET-32a-aroG，pET-32a-trpBA的E.coliDH5α转化菌单菌落，接种到LB培养基中，37℃振荡过夜培养，按2％接种至终体积为60mL的液体LB培养基中，30℃培养至菌液OD600=0.5～0.6，迅速置于42℃诱导培养4～5h。SDS检测(凝胶浓度为15％、考马斯亮兰染色)。 　　2结果 　　2.1 pET-32a-aroG，pET-32a-trpBA基因的PCR扩增 　　PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，可见得到1400bp和2500bp左右的目的片段。 　　2.2重组表达质粒pET-32a-aroG，pET-32a-trpBA的鉴定 　　PCR产物经酶切回收后分别与pET-32a载体连接，依次转化至E.coliDH5α，挑选单菌落，提取质粒，可见大小分别为8400和7200两条带，与预期相符。经全序列测定，确定目的片段正确连接至表达载体，转化受体菌E.coliDH5α，筛选获得重组子。 　　2.3 pET-32a-aroG，pET-32a-trpBA表达的检测 　　按上述方法培养并诱导含pET-32a-aroG，pET-32a-trpBA的E.coliDH5α菌株，经SDS分析，重组子pET-32a-aroG，pET-32a-trpBA比E.coliDH5αpET-32a多3条诱导表达带，分别与预期的aroG、trpBA的相对分子质量一致。 　　2.4 DAHP合成酶和色氨酸合成酶的酶活性比较 　　按前述方法测定DAHP合成酶和色氨酸合成酶的酶活，以E.coliDH5α菌株的粗提物酶活性比为1，相对于携带pET-32a质粒的宿主菌，其DAHP合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了3.6倍和2.8倍。 　　3讨论 　　谷物饲料中色氨酸的含量远远低于其他必要营养组分，色氨酸通常是第三或第四限制氨基酸，在猪的玉米－豆饼型饲料中还可能是第二限制氨基酸。色氨酸的代谢产物5－羟色氨在动物体有抗高密