酵母表达系统和方法.pptVIP

* 酵母表达系统与方法 酵母表达系统的产生 基因工程技术的发展为用微生物合成和生产外源蛋白展示出广阔的前景。长期以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠杆菌具有若干优点，如：遗传背景和生化特性清楚、容易操作、生长迅速、营养需求简单等。 但大肠杆菌表达系统存在若干缺陷：A：缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等；B：表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性；C：背景杂蛋白很多、纯化起来麻烦；D：表达量一般不是很高。 自1979年，为了克服大肠杆菌表达系统的缺点，发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母，因为酿酒酵母在酿酒业和面包业使用有数千年的历史，被认为是安全生物；此外，酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物的易于培养、繁殖快、便于基因工程操作等特性，同时又具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能，有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统，还能分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化，并可减轻宿主细胞的代谢负荷。特别是由于酿酒酵母2μ质粒的发现和酵母转化技术的突破,酿酒酵母基因工程表达系统因此而建立并应用。 1981年Hizeman等人首次报道了人重组干扰素基因在酿酒酵母中表达并获成功。 酵母表达系统的组成 ◆宿主：酿酒酵母、裂殖酵母、乳酸克鲁维亚酵母、 巴氏毕赤酵母等。 ◆质粒载体 1. 质粒类型: 自主复制型质粒（Yeast replicating plasmid, YRp） 着丝粒质粒（Yeast centromeric plasmid, YCp ） 附加体质粒(Yeast episomal plasmid,YEp) (自主复制,拷贝数高,不稳定, 易丢失) 整合型载体(Yeast integrating plasmid,YIp) (稳定性好,拷贝数低) YAC载体（Yeast artificial chromosome, ） 2. 选择标记: A.营养缺陷型选择标记(亮氨酸合成酶基因leu2,色 氨酸合成酶基因tri1,尿氨酸合成酶基因ura3,组氨 酶合成酶基因his3) B.显性选择标记(氨基酸糖甙类抗生素G418,氯酶素， 潮酶素) 3. 外源基因表达的相关元件:启动子(pgk1,AOX, LAC4)、终止子 分泌信号序列 主要酵母表达系统 ◆酿酒酵母表达系统 Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母) ◆乳酸克鲁维亚酵母表达系统 Kluyveromyces lactis （乳酸克鲁维亚酵母） ◆甲醇营养型酵母表达系统 Candida bodinii Hansenula polymorph(多形汉逊酵母) Pschia methanolica Pichia pastoris(巴氏毕赤酵母) ◆裂殖酵母表达系统 Schizo saccharomyces pombe （粟酒裂殖糖酵母） 不同酵母表达系统的特点 ◆ 酿酒酵母表达系统 表达载体：自主复制型和整合型 筛选标记: LEU2、URA3 启动子： PGK1、 PHO5、CUP1 成功表达的外源蛋白实例： 人重组干扰素 酿酒酵母表达系统的主要不足： 分泌能力低 不能使异源蛋白正确糖基化 所表达的蛋白质的C-末端被