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MK对人脐静脉内皮细胞增殖及迁移影响 　　[摘要] 目的 通过研究midkine（MK）蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、迁移的影响，阐明MK蛋白在血管生成中的作用。方法 选择HUVEC为研究对象进行细胞常规培养，分为5组分别给予不同浓度MK进行干预，实验组MK浓度分别为0.5、5、50和 500 ng/ml，以未处理组作为对照组。利用CCK-8试剂盒检测MK对HUVEC增殖能力的影响，利用Transwell技术检测MK对HUVEC迁移能力的影响。结果 与对照组相比，5 ng/ml的MK作用24 h和48 h可以促进细胞增殖，差异有统计学意义（P 　　[关键词] MK；人脐静脉内皮细胞；增殖；迁移 　　[中图分类号] R730.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）12（b）-0010-03 　　Midkine（MK）是一种新的肝素结合生长因子，是由Kadomatsu等[1]用差异杂交的方法在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM-1细胞cDNA文库中筛选出的基因。MK在多种肿瘤组织中高表达，在相应的癌旁组织中低表达，并且可能与肿瘤血管形成导致肿瘤的生长恶化有关[2-4]。笔者前期采用免疫组织化学技术检测MK在乳腺癌及其癌旁组织中的表达水平，并分析其与微血管密度（MVD）的关系，结果发现MK在乳腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，发现MK与乳腺癌中血管形成密切相关[5]。本研究选用人乳腺癌组织和人脐静脉皮细胞为研究对象，探讨探讨MK蛋白在乳腺癌发生发展中的作用及其对肿瘤血管形成的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞株 人脐静脉内皮细胞株HUVEC购自南京凯基生物科技发展有限公司。 　　1.1.2 主要试剂及耗材 重组人Midkine蛋白购自Pecrotech公司，CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司，RPMI 1640购自美国Gibco公司，胎牛血清（fetal calf serum，FCS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，Transwell小室及细胞培养板购自美国Costar公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 HUVEC细胞常规培养于含有10%胎牛血清（四季青）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，在37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中贴壁培养，取对数生长期的细胞进行实验。 　　1.2.2 MK对HUVEC增殖能力的影响 将不同浓度的MK作用于HUVEC，培养24 h和48 h后分别采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。实验组MK浓度分别为0.5、5???50和 500 ng/ml，以未加MK处理组作为对照组，共5组。取对数生长期的细胞，用胰酶消化后，计数，调整细胞浓度为5×104/ml，按每孔100 μl接种细胞悬液至96孔板，每组9个复孔，于培养24 h和48 h后每孔中加入10 μl WST-8，继续培养4 h，于酶标仪上450 nm处比色，获得吸光度（D）值。 　　1.2.3 MK对HUVEC迁移能力的影响 Transwell技术检测MK对HUVEC迁移能力的影响，将细胞接种至24孔板Transwell小室的上室，培养24 h。PBS冲洗2次，甲醇中固定30 min，晾干后于1%结晶紫染液中染色25 min。倒置显微镜下每孔取10个视野，计算穿至小室膜下的细胞数。每个样品三复孔，实验重复三。 　　1.3统计学方法 　　采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法，以P0.05，P=0.7880.05，P=0.2060.05，P=0.3700.05，P=0.5530.05，P=0.6050.05）（表1、图1）。 　　2.2 MK对HUVEC迁移能力的影响 　　与对照组相比，浓度为5 ng/ml的实验组穿过PET膜上8 μm小孔的细胞数明显增多，差异有统计学意义（P=0.0080.05，P=0.2540.05，P=0.0910.05）（表2、图2、图3）。 　　3 讨论 　　肿瘤细胞生长的微环境中包括多种因素，如内皮细胞、成纤维细胞、各种免疫细胞，其中，肿瘤相关的内皮细胞在肿瘤的生长发展中扮演重要角色[6]。新生血管形成在肿瘤细胞的生长与转移中具有重要的意义。它是一个细胞与细胞、细胞与基质之间相互作用的复杂过程，包括血管内皮细胞外基质的降解、内皮细胞向基质降解处的迁移、增殖、伸展、管状结构的形成及内皮细胞外的基质膜的产生等多个步骤。对肿瘤新生血管形成的研究，不仅可以预测肿瘤的预后，而且抑制肿瘤新生血管形成作为防治实体瘤生长与转移的靶点也有很大的前景。