第七章 蛋白质分分离纯化与表征2010.ppt

等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。 等离子点(isoionic piont): 蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。 二、蛋白质的分子大小与分子量的测定 蛋白质的分子量的范围：6×103～1×106 Da。 （二）渗透压法测定相对分子量 （三）沉降分析测定Mr 在强大的离心场中，如果蛋白质溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白质会发生沉降。 沉降速度决定于蛋白质的分子量、分子密度、分子形状和溶剂的密度、粘度。 沉降系数（Ｓ20,w）：单位离心场强度时的沉降速度。定义1Ｓ＝10-13秒（斯维得贝格单位）。 Mr = RTS÷D(1－Vρ) （四）凝胶过滤法测定Mr 凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。 （五）SDS法测定Mr 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。 当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。 五、蛋白质分离纯化的一般原则 根据分子量：如沉降速度法离心 根据密度：沉降平衡法离心 根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据分子量和分子形状：凝胶过滤 根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀 根据电荷：等电点沉淀 六、蛋白质的分离纯化方法 透析：利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析。 超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，有时要用切向流过滤法。 （二）利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取决于他们本身的分子结构。 等电点沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为电中性，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技术。 盐析：当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。 有机溶剂分级分离法：引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数。 温度对蛋白质溶解度的影响：0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。 （二）蛋白质纯度鉴定 电泳、沉淀、HPLC、N末端测序等 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。 若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。 物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。 离子交换： （六） 亲和层析 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的 。 抗原和抗体 激素和受体蛋白 凝集素和糖蛋白 配体 蛋白质 蛋白质和配体复合物 交联试剂 载体 配体 载体与配体交联体 杂质 杂质 游离配体 七、蛋白质的含量测定与纯度 测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。 溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。 （一）蛋白质的含量测定 * 第七章 蛋白质的分离纯化和表征 一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的分子大小与分子量的测定 三、胶体性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质的变性与复性 五、蛋白质分离纯化的一般原则 六、蛋白质的分离纯化方法 七、蛋白质的含量测定与纯度 一、蛋白质的酸碱性质