实验2 大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化RJ2.ppt

实 验 材 料 （一）仪器与器皿 恒温振荡器，分光光度计，电动沉淀离心机，旋涡混合器，恒温培养箱，电热恒温水浴锅，恒温摇床，普通冰箱，Eppendorf管，转液管，平皿，涂布棒，微量取样器，微波炉，三角烧瓶，试管，刻度离心管，保温瓶，酒精灯等。 （二）菌种 大肠杆菌Top10或DH5α （三）培养基与试剂 1．LB培养基：胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCL 10g，调pH7.5，定容至1000ml 2．100mmol/ L CaCl2； 3．氨苄青霉素溶液（50 mg/ml）； 4．质粒DNA:pcDNA3.1-p38 5．含Amp 的LB 固体培养板：将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp 储存液，使终浓度为50μg/ml，摇匀后铺板。 实 验 步 骤 （一）感受态菌制备 1．将受体大肠杆菌在平板上划线，置于恒温培养箱中37 ℃培养过夜，挑取一个单菌落（直径2~3mm）接种于3 ml LB试管中，37 ℃摇床培养（200~300r/min）过夜（约16 小时），必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致，有无杂菌污染。 2．无菌条件下用加样器吸取过夜培养液1 ml，接种于新鲜的LB 中（100 ml LB/250 ml三角瓶，接种量按菌液浓度而定，一般在1%左右），于37℃恒温摇床培养培养2-3 小时。 3.分光光度计测OD550的光密度值，待OD值约为0.2~0.5 左右时, 将3ml培养液转入离心管中，冰上放置20分钟，3000 rpm 4℃离心5~10分钟。 4．弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液30 ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15~30分钟后，3000 rpm 4 ℃离心10分钟。 5．4 ℃，4000 rpm离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液，加入含10 %甘油的4 ml预冷0.1 mol/L CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置5分钟，即成感受态细胞悬液。 6．感受态细胞分装成100 μl的小份，至4 ℃保存备用，24-48小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于-70℃的低温冰箱中。 注意事项：整个过程在冰上，轻柔操作。 实 验 步 骤 （二）大肠杆菌转化 1．从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞，放置冰上缓慢溶化，放置10 min。 2．分别取2管100μl感受态细胞悬液，第一组为转化实验组：10 μl重组质粒DNA+100μl感受态细胞；第二组为阴性对照组；加入同体积无菌水+100μl感受态细胞悬液；轻轻摇匀，冰上放置30分钟。 3．将管放入42 ℃恒温水浴中90秒，迅速将eppendorf管移到冰浴上，冷却2 min。 4．向上述eppendorf管中加入0.8 ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37 ℃振荡培养45~60min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。 5．将上述菌液摇匀后取100~200μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12~16小时。 注 意 事 项 感受态细胞制备及转化中的影响因素 1．细胞的生长状态和密度 最好从-70℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。 2．质粒DNA的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但外源DNA的量过多时，则会使转化率下降。一般来讲，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50 μl的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍。 3．试剂的质量 化合物及无机离子的影响：所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4℃。在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。 4．防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 5．整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降