RNA 注意.docVIP

实验室的普通器皿和塑料制品使用前必须于180℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）可用氯仿冲洗（塑料制品）。 提取用所有的玻璃器皿可通过高温灭活（160℃烘烤4-5 h）去除RNase。 RNA样品所接触的所有塑料制品（如枪头、电泳槽、移液器等都需要通过DEPC或NaOH处理严格去除RNase后才可使用 用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活 植物叶片总RNA试剂盒的采购从华舜生物 DEPC 　　焦碳酸二乙酯（DEPC）：DEPC即diethypyrocarbonate，中文名为焦碳酸二乙酯。分子式为C6H10O5，分子量为162.14。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。DEPC可以抑制植物细胞上的NSCC,是常用的NSCC抑制剂.　　DEPC毒性：　　1．DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯) 是一种高效烷化剂。 配置：加0.1% DEPC到去离子水中，混匀过夜，然后高温高压121℃， 20min， DEPC即降解成二氧化碳和水无毒。 配制DEPC处理水时需剧烈振荡使DEPC与水充分接触反应（DEPC与水反应后会产生大量的气体，可用塑料膜将瓶口扎紧，剧烈混匀后通过观察塑料膜是否胀气来判断反应是否充分）。 DEPC处理后应避光静置过夜，高压灭菌。　　2．DEPC有刺激性，对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。　　3．DEPC是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。 植物总RNA的提取步骤（每一步均要求无RNase污染）1.称取新鲜材料100 mg，液氮速冻；2.在预冷的研钵中并在液氮中将材料研磨成细粉末，转移到2ml或1.5ml离心管中；3.待液氮挥发（但不能解冻）后，加入 450 μl提取缓冲液RLT，混匀后在56下温育1～3min；4.将裂解液加到离心柱（淡紫色）上下接一个2ml收集管，最大转速离心2min。裂解液通过柱子时被均质化小心吸取上清液，转移到另一新离心管；5.加入0.5倍体积（225 μl）96～100%乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能会出现沉淀，无影响；6.将混合液全部（包括沉淀675 μl）转移到吸附离心柱（粉红色）内， 下接2 ml的收集管，10000 rpm离心 15秒。弃去管内液体；7.加入700μl RW1缓冲液，10000rpm转速下离心25秒，弃去收集管；8.将离心柱转移到一个新的2ml收集 管上，加入500μl RPE缓冲液， 10000 rpm离心15秒，弃去管内液体 重复使用收集管；9.加入500μl RPE到离心柱内，最大转速离心2min，干燥离心柱，弃去收集管； 10.把离心柱接在一个新的1.5 ml Eppen管上，加入30～50μl 无RNase水（0.1%DEPC处理），10000 rpm离心 1min，洗出RNA。若RNA产量在20μg以上，用30～50 μl无RNase水再洗脱1次。RNA样品保存于-20备用。琼脂糖凝胶甲醛变性电泳1.制备凝胶(1.2％)：称1.2克琼脂糖，加72ml DEPC处理的水，加热溶化。冷却至60oC，在通风厨内加入10×凝胶缓冲液10ml， 甲醛（37％）18ml， 混均后到入凝胶模具中。2.样品制备：在离心管里，将RNA样品与10×样品缓冲液以9：1比例混合。65oC温浴5－10分钟， 迅速在冰上冷浴5分钟， 瞬时离心数秒。对于Northern杂交实验，总RNA上样量可达到10-30μg。3.上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。以5V/cm的电压电泳1.5h-2.0h。4.待溴酚蓝迁移至凝胶长度2/3-4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液(0.5 μg/mL，用0.1mol/mL乙酸胺配制)中染色30min。5.在紫外灯下观察结果。 植物RNA提取过程中难点的相应对策酚类化合物的干扰及对策：许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browning effect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Ne