急性肺损伤大鼠肺组织神经导向因子Slit2与Robo4的表达急性肺损伤大鼠肺组织神经导向因子Slit2与Robo4的表达.docVIP

描述：目的 观察神经导向因子Slit2及Robo4在肺组织的表达并探讨二者在ALI发病中的作用。方法 在南华大学实验动物部将48只SD雄性大鼠随机（随机数字法）分为对照组（n=24）与ALI组（n=24）。... 临床上脓毒症作为ALI/急性呼吸窘迫综合征（acute?respiratory?distress?syndrome，ARDS）的间接诱因，常可伴发ALI/ARDS。随着肺保护性通气策略的推广，ALI的病死率已趋下降，但仍高达30%～40%。Mac?Sweeney等研究发现，在早期对ALI进行积极治疗，能够有效阻断MODS中各器官衰竭的序贯进行，从而提高危重症患者的治愈率。以往对于ALI发病机制的研究集中在“瀑布样”炎症反应导致肺上皮细胞及血管内皮细胞受损。分泌性糖蛋白Slit与其配体Robo最初只被定义为神经导向因子中的一员，2010年，Lee和Slutsky研?究发现Slit2/Robo4信号通路与白细胞的迁移、血管的生成及维持内皮功能的稳定有一定的关系，但对Slit2及Robo4在急性肺损伤发病机制中?的作用方面的研究尚不多。本研究通过观察ALI大鼠肺组织神经导向因子Slit2及Robo4的表达，探讨二者在脓毒症ALI发生、发展中的作用。?　　1?材料与方法?　　1.1?主要材料?　　清洁级雄性SD大鼠48只，体质量（250±20）g，购自南华大学实验动物部。TNF-α、IL-6（ELISA）试剂盒购自武汉博士德生?物工程有限公司；伊文思蓝（大连美仑生物科技有限公司）。Trizol（美国Invitrogen公司），cDNA逆转录试剂盒（美国fermentas?公司），内参照β-actin，Slit2和Robo4的特异性引物（上海桑尼生物科技有限公司），兔抗大鼠Slit2多克隆抗体及兔抗大鼠Robo4多?克隆抗体（北京博奥森生物有限公司）。PCR扩增仪（美国Axygen公司）。血气分析仪（瑞士Roche公司OPTICCA型）。?　　1.2?动物分组?　　48只SD大鼠按随机数字表法分为对照组24只和ALI组24只。参照Rittirsh等[5]报道的盲肠结扎穿孔术?（cecum?ligation?and?puncture，CLP）?复制脓毒症ALI模型。动物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，无菌条件下，取正中切口开腹，将盲肠移出腹腔，在其根部结扎，用18号针贯穿2次，挤出少量?肠内容物，留置2?cm皮瓣防止针孔闭合，还纳盲肠于腹腔，缝合切口，置笼内活动，不禁饮食。对照组只开腹、关腹，不行盲肠结扎穿孔。每组又分为术后12、24、48?h?3个时间点组，每组8只大鼠。ALI造模成功标准如下：①有肺上皮细胞及肺血管内皮细胞损伤的证据（血液、肺支气管灌洗液或?肺组织局部有相应的细胞应子或酶的变化）；②病理切片上轻度肺水肿，或仅有间质性水肿，无透明膜形成；③有肺血管通透性升高的证据；④氧分压下降，同时满?足4点即判定为负荷急性肺损伤模型。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。?　　1.3?检测指标及方法?　　两组按不同时间点采颈动脉血0.5?mL，采用血气分析仪测定动脉血氧分压（PaO2）。各观察时间点分别取各组大鼠?8只，用10%水合氯醛（3?mL/100?g）腹腔注射麻醉，开胸经心脏取血，置于不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，?3000?r/min离心10?min将血清和红细胞迅速小心地分离，即得血清，于-80?℃超低温冰箱保存。取右下肺组织用于测定肺湿干质量比（W/D），左下肺组织测定伊文思蓝含量，留取适量肺组织，置于1.5?mL?EP管中，并放适量RNA保存液，右肺组织用4%多聚甲醛溶液固定，用于石蜡包埋、备做HE染色及免疫组化。?　　1.3.1?大鼠血清TNF-α质量浓度检测?严格按试剂盒操作说明书进行，选择450?nm波长进行检测，确定标准品和空白对照区域，由酶标检测仪自动检测计算并绘制标准曲线，计算检测结果。?　　1.3.2?肺毛细血管通透性检测?两组大鼠于麻醉后处死前30?min经尾静脉注射伊文思蓝，水合氯醛腹腔注射后开胸心脏取血，立即处死并取少量左下肺，将肺组织浸泡于甲酰胺溶液，37?℃恒温箱中温浴48?h，待组织中色素浸出，取出肺组织，离心10?min后取上清液，用分光光度计（波长620?nm）比色，根据标准曲线计算伊文思蓝的含量，以此反映肺血管壁通透性改变。?　　1.3.3?肺W/D比值测定?将右下肺组织称质量（湿质量）后置于70?℃烘箱内，真空条件下烘烤48?h称干质量，计算肺W/D比值。?　　1.3.4?肺组织病理观察?取右上肺组织置4%多聚甲醛溶液中，依次进行脱水、石蜡包埋、制成切片，苏木精-伊红（HE）染色后光镜检查。?　　1.3.4?医教论文 1.3.5