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生化试验课件实九：聚合酶链式反应
聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction） 实验步骤 1、反应体系的配制 2、PCR反应 预变性 94℃ 5min 变性 94℃ 30s 退火 54℃ 45s 延伸 72℃ 45s 末次延伸 72℃ 3min 3、琼脂糖电泳观察结果 10μl PCR反应产物，加2μl上样缓冲液； 2%琼脂糖凝胶，90~120mA，电泳20~ 40min； 紫外分析仪观察结果。 * 目 录 * 目 录 实验九 核聚变 刘向华 南京医科大学 生化与分子生物学系 Nanjing medical university Department of biochemistry and molecular biology 实 验 目 的 掌握PCR实验的基本原理与操作方法 理解PCR在分子生物实验技术中的重要性 了解引物设计的一般要求 实 验 原 理 基本原理：体外模拟体内的DNA复制 PCR体系 模板DNA(template) 寡核苷酸引物(primer) DNA聚合酶(polymerase) 合适的缓冲液(buffer)系统 Mg2+ 目的基因或DNA片段在体外高效、快速、特异地扩增。 单脱氧核苷酸(dNTP) PCR过程 DNA变性(denaturation)——DNA双链解链变为单链 退火(annealing)——DNA复性，引物与模板结合 延伸(extension)——引物沿5→3端延伸合成新链 1个循环(cycle) 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C PCR的产物数目 以指数级方式增长 DNA片段 Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Cycle N 理论上可达2n个拷贝 原料（pg） 产物(ug) 目的基因或DNA片段在体外高效、快速、特异地扩增 g → mg → ug → ng → pg Plateau Effect in PCR Amplification PCR扩增的平台期 ddH2O 10×PCR反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 4种dNTP的混合试剂 上游引物（Forward） 下游引物（Reverse） Taq DNA聚合酶 模板DNA(约1ng) 2μl 48μl 35.5μl 5μl 3μl 2μl 1μl 1μl 0.5μl 50μl 20-30 cycles 负极 正极 实验结果 注意事项 1、各种试剂的用量均非常微小，注意微量移液器的 使用，避免不当操作造成的误差； 2、不要在管壁上做标记，以免影响PCR仪的导热性； 3、注意琼脂糖凝胶电泳中EB的污染 4、所用的PCR扩增管、枪头都要灭菌。 5、每次实验都要设置阴性和阳性对照。 6、根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现 非特异性扩增产物。 本实验扩增的DNA片段是基因组中的P53基因。P53基因是以蛋白质产物的分子量命名的，它由16-20kb组成，定位于人17号染色体， 基因组有11个外显子。 P53基因是抗癌基因。 P53基因的突变或缺失， 是许多肿瘤发生的原因。
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