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PAGE PAGE 17 微生物学及实验 （实验部分） 教 学 讲 义 教 学 讲 义年第二学期 刘 莉 实验一 显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色 一.实验目的：了解并掌握油镜的原理和使用方法；掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。 二.实验原理： 1.油镜工作原理 油镜的放大倍数最大(100),故镜头焦距短,直径小,但所需光照强度却最大.从标本片透过 的光线是从玻片进入空气,再进入镜头.由于玻璃和空气的介质密度不同,有些光会因折射或反射而不能进入镜头.物象就显现不清.为了不使通过的光线所损失,须在油镜与玻片之间加才入折射率和玻璃(n=1.52)相仿的香柏油(n=1.515).故而称之为油镜. 增加显微镜的分辨率：分辨率是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。D=0.61λ/n·Sinα/2 (其中D为分辨率；λ为波长，可见光为0.4～0.7μm；n为介质折射率，α为物镜镜口角，即光线的最大入射角的半数，它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到120度)。油镜是通过增加n值来提高介质的分辨率的，若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径n·Sinα的值通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体，而油镜的最大分辨率可达0.2μm; 而电镜是通过使用电子束作为光源，减小λ值来提高分辨率的（可见光的λ值为400—700nm而电子束的λ值为0.01—0.9mn）。 2. 革兰氏染色的工作原理： 1884年丹麦病理学家Christain Gram创立的，而后一些学者在此基础上做了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现负反应。 是根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的结构差异来达到染色的目的的。先用结晶紫初染，像简单染色法一样，所有的细菌都被染成初染料的蓝紫色；然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫—碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。然后再用乙醇脱色处理由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩，结晶紫—碘不易被洗脱而保留在细胞内，复染时仍保持蓝紫色。而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透性增大，结晶紫—碘复合物被洗脱，复染时细胞被染上复染剂的颜色（红色）。 三.实验用品：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌；革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。 四.操作方法： 1. 显微镜的操作方法： 2. 革兰氏染色的操作方法： （1）涂片：先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平板上取一小环培养24小时的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体于生理盐水中涂片（，分别于斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开，使其分布均匀。 注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚 = 2 \* GB2 ⑵ 干燥：把上面涂好的片于室温下自然干燥。 = 3 \* GB2 ⑶ 涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体（此操作的目的是使得细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上）。固定时通过火焰1—2次即可。 注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞形态。 = 4 \* GB2 ⑷ 初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染1--2分钟min，水洗。 = 5 \* GB2 ⑸ 媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。 = 6 \* GB2 ⑹ 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。 注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。 = 7 \* GB2 ⑺复染：用番红液染1—2min,水洗。 = 8 \* GB2 ⑻镜检：干燥后（室温下晾干），置油镜观察（先在低倍镜，然后在油镜下观察菌体细胞的形态）。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到最合适的观察点。 油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸