第十四章 分子荧光分析法.pptVIP

第三节 溶液的荧光强度 一.荧光强度与溶液浓度的关系 荧光是由物质吸收光能后发射而出，因此，溶液的荧 光强度 F 和溶液吸收光能的程度以及物质的荧光频率有关： F ∝（I0-It）→ F = K’（I0-It） K’ 为常数，取决于荧光物质的量子效率Φ，根据L—B定律： 所以 F = K’ ( I0-I010-εbc) = K’ I0 ( 1-10-εbc) = K’ I0 ( 1-e-2.303εbc ) 将式中 e-2.303εbc 展开，得 当 2.303εbc ? 0.05 时(浓度很小，溶液较稀时），上式括 号内第一项以后的各项均可忽略不计，所以： F = K’I02.303εb c 对于一荧光物质的稀溶液，当 I0 及 b 一定时， F = K·C 即在低浓度（2.303εbc ? 0.05）时，溶液的荧光强度与 荧光物质的浓度呈（线性）正比关系。 由此过程可看出： F ∝ I0（浓度、b 一定时），因此入 射光越强 I0 ↑ →F ↑，所以荧光分析的灵敏度比较高；而在 紫-可分光光度法中， ，增加 I0 ，并不影响 A，所以不能灵敏度提高。 二. 定性分析 通过比较标准物质和待测试样的激发光谱和发射光谱 （荧光光谱）定性。 三. 定量分析 1. 校准曲线法： 配制一系列浓度梯度的待测物的标准溶液，同空白溶液， 使样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：Fs、F0、Fx， 然后作（ Fs - F0）— C 曲线，根据（Fx–F0)，从工作曲线上 求得待测物的浓度（或含量）。 2. 直接比较法 如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可选择其线性范围，用直接比较法进行测定： FsˉF0 = KCS K 相同 FxˉF0 = KCx 四. 影响荧光强度的外界因素 1. 激发光源：一般选用?ex 最大 但对某些易感光、易分解的荧光物质，尽量采用长波长，低 I0 及短时间光照 2. 温度：大多数分子在温度升高时，分子与分子之间，分 子与溶剂分子之间的碰撞频率升高，非辐射能量转移过 程升高，? 降低，因此，降低温度，有利于提高 ? 。 3. 溶液的 pH：带有酸性或碱性环状取代基的芳香组化合物 的荧光一般都与 pH 值有关，有些化合物在离子状态时 不显荧光，如苯胺： pH 7-12为分子状态 pH 2时 pH 13时 发生蓝色荧光 不发生荧光 不发生荧光 为此，在用荧光强度进行定量测定时，严格控制溶液 pH 值是非常重要的。 4. 溶剂 对π-π共轭的荧光物质（大多数荧光物质为之） 在极性溶剂中，ΔE 减小↓ →跃迁几率升高↑ → ?↑ （波长长移） 溶剂粘度 ↓ → ?↓ 5.内滤光作用和自吸现象：使荧光强度下降 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾； 6、散射光的影响（溶剂的二种散射） （1）瑞利散射光：物质（溶剂或其它分子）分子吸收光能 后，跃迁到基态的较高振动能级，在极 短时间（10-12s）返回到原来的振动能级 并发出和原来吸收光相同波长的光，这 种光称为瑞利散射光。 6、散射光的影响（溶剂的二种散射） （2）拉曼散射光：物质分子（溶剂）吸收光能后，若电子 返回到比原来能极稍高（或稍低）的振 动能级而发射的光称为拉曼散射光。 瑞利散