第一章-基因工程分子遗传学原理.pptVIP

KpnⅠ＋EcoRⅠ/ 外切酶Ⅲ缺失 KpnⅠ＋ ApaⅠ/ 外切酶Ⅲ 缺失 BgⅢ/外切酶 Bal31缺失 用限制性酶和外切核酸酶来产生缺失突变。根据质粒中插入DNA的酶切图谱，可以确定从克隆片段的中部或末端删除掉一些核苷酸。 BgⅢ和BamHⅠ剪切的结果产生互补的黏性末端(GATC)。但如果此DNA末端没有延伸的3突出端的话，外切酶Ⅲ从3端消解DNA的一条链。这些特点可被通过两种限制酶的剪切，产生非定向的缺失。 一种剪切5突出端(EcoRⅠ或BanHⅠ)，而另一种剪切3突出端(KpnⅠ或 ApaⅠ)。 外切酶Ⅲ-缺失DNA必须用剪切单链的核酸酶S1来切除未被消解的5端。 外切酶Bal31消解双链DNA产生两端缺失，此不需要用核酸酶S1处理就可用于平端连接。 接头分区诱变 （linker scanning mutations） 接头分区诱变能用于产生一系列小的内部缺失和一簇 点突变。产生的5 和3端缺失的集合，每一个都含有8 个碱基的限制性酶切位点和末端相连。例如，XhoⅠ 接头 (GCTCGAGG)中含有一个回文XhoⅠ识别序列 (CTCGAG)。通过消解选择性缺失带有XhoⅠ的片段， 然后连接，这样在靶DNA(LSl -LS3 和LS-2-LS-4)上 能产生嵌套(nested)点突变。 TTCGAGTTCGGCATTGCCATAG AAGCTCAAGCCGTAACGGTATC TTCGAGTTCGGGC AAGCTCAAGCCCGAGCT TTCGC AAGCGAGCT TCGAGGTAG CCATC TTCGAGTTCGGGCTCGAGGTAG AAGCTCAAGCCCGAGCTCCATC TTCGCTCGAGGCATTGCCATAG AAGCGAGCTCCGTAACGGTATC TTCGCTCGAGGTAG AAGCGAGCTCCATC 靶DNA野生型 末端缺失 接头分区突变 TCGAGGCATTGCCATAG CCGTAACGGTATC 内部缺失 LS1 LS2 LS3 LS4 LS1-LS3 LS2-LS4 LS2-LS3 XhoⅠ接头(GCTCGAGG)连接后剪切 （二）、寡核苷酸定向诱变 定点诱变(site-directed mutagenesis或)也称 位点专一性诱变（site-specific mutagenesis），或定向诱变（directed mutagenesis），是指在体外使基因或DNA分子某一特定的位点发生特定的突变。 Michael Smith （ 1932,4- ） The Nobel Prize in Chemistry 1993 Kunkel 定点诱变法 1985由T.A.Kunkel年建立。 (1)将已插入目的DNA的M13 (RF)转化入E.coli(dut--ung-)进行复制,子链中掺入了U； (2)与突变引物退火:取正链M13与突变引物退火; (3)制备异源双链：用Kleanow酶，和T4连接酶在体外合成异源双链； (4)将异源双链转化入野生型E.coli中，尿嘧啶脱糖苷酶(Ung)降解含U的模板，仅含突变DNA的模板可得到扩增。 G G G U G A A M13 将已插入目的DNA的M13 (RF)转化E.coli(dut -ung-) 进行复制,子链中掺入了U 取正链M13与 突变引物退火 A 用Kleanow酶和 T4连接酶在体外 合成异源双链 将异源双链转化入野生型E.coli中尿嘧啶脱糖苷 酶(Ung)降解含U的模板 仅含突变 DNA的模板 可得到扩增 U U U U U U U U G A U U U U U U U U A E.coli dUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。 尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和无Py位点（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。  尿嘧啶 N-糖基 化酶 AP内切酶 AP DNA PolⅠ GA G A C T T ,,, ,,G A C T T G A C T ,T ,,, G A C T T C U G A A ,,,,,,,, C G A A