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沙利度胺抑制小鼠T淋巴瘤实验研究 　　[摘要] 目的 观察沙利度胺对小鼠T淋巴瘤的抑制作用。 方法 32只BALB/C小鼠皮下接种鼠T淋巴瘤白血病细胞（EL-4细胞）建立模型，第2天随机分成4组，每组8只：①阴性对照组：小鼠8只，生理盐水灌胃25 mL/（kg·d）；②低剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃50 mg/（kg·d）共14 d；③中剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃200 mg/（kg·d）共14 d；④高剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃400 mg/（kg·d）共14 d。每2日测肿瘤直径，计算体积，用药后15 d处死小鼠，分离肿瘤，计算抑瘤率。第2批小鼠同样方法处理，记录平均生存期。用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数。RT-PCR法测TNF-α mRNA表达。 结果 各组瘤重较阴性对照组减小，抑瘤率分别为17.75%，36.73%，42.04%，差异有统计学意义（P 　　[关键词] 沙利度胺；淋巴瘤；TNF；凋亡 　　[中图分类号] R733.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0123-03 　　恶性淋巴瘤在我国虽然发病率不高，但恶性程度高，预后较差，特别是T细胞淋巴瘤经综合治疗5年生存率仅为30%[1]。沙利度胺（反应停，酞咪哌啶酮，Thalidomide）因导致胎儿畸形于20世纪60年代被禁用。1994年以来研究发现其具有调节机体免疫，抑制肿瘤血管生成等作用而用于多种肿瘤的治疗[2]。本文观察了沙利度胺对小鼠移植性T淋巴瘤的抑制作用，为其更好地应用于临床提供一定的实验依据。 　　1 仪器与材料 　　1.1 细胞株及实验动物 　　BALB/C纯系雌性小鼠，体重18～22 g，6～8周龄，购于河南省实验动物中心。EL-4细胞（鼠T淋巴瘤白血病细胞株）购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。 　　1.2 药品、试剂、仪器 　　沙利度胺由常州制药厂生产，批号：0508241。原位细胞凋亡检测试剂盒（POD），购自华美生物工程公司。TNF-α引物由上海生工生物有限公司合成，上游引物序列：5-AGT CCG GGC AGG TCT ACT TT-3，下游引物：5-GCA CCT CAG GGA AGA GTC TG-3，扩增产物为422 bp。β-actin上游引物序列：5-CCA GAG CAA GAG AGG TAT CC-3，下游引物序列：5-GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA-3，扩增产物为276 bp。Trizol购于invitrogen公司，rTag酶购于TaKaRa公司。 　　2 方法 　　2.1 模型的建立 　　EL-4细胞???浮生长于含15%胎牛血清的RPMI 1640培养液置培养箱。培养条件：37℃，5%CO2。选生长对数期细胞用于实验，无菌生理盐水调细胞浓度为5×106个/mL。取悬液0.2 mL接种于32只BALB/C小鼠右腋部皮下。 　　2.2 抑瘤率实验 　　接种后第2天，将32只小鼠随机分为4组，每组8只。①阴性对照组：小鼠8只，生理盐水灌胃25 mL/（kg·d）共14 d；②低剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃50 mg/（kg·d）共14 d；③中剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃200 mg/（kg·d）共14 d；④高剂量组：小鼠8只，沙利度胺灌胃400 mg/（kg·d）共14 d。观察小鼠体重，并用游标卡尺测肿瘤直径，计算肿瘤体积。于用药后第15天处死小鼠，分离肿瘤，计算抑瘤率。第2批32只小鼠同样方法建立模型分组记录平均生存期。公式：瘤体积=ab2/2（a为肿瘤最长径，b为肿瘤最短径）；抑瘤率=（对照组瘤重-给药组瘤重）/对照组瘤重×100%。 　　2.3 HE染色 　　将石蜡切片，常规脱蜡、乙醇梯度脱水，苏木素-伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。 　　2.4 TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡 　　取肿瘤组织，10%福尔马林固定24 h，脱水包埋，4 μm连续切片，按试剂盒说明操作。显微镜下观察：以细胞核中出现棕黄色颗粒作为阳性细胞，计算凋亡指数（apoptosis index，AI）：凋亡细胞占全部肿瘤细胞的比例，在高倍镜下计数每100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，每例至少计数1000个肿瘤细胞，取其平均数。 　　2.5 RT-PCR法检测TNF-α mRNA的表达 　　2.5.1 常规提取肿瘤组织RNA 用TaKaRa公司cDNA第一链合成试剂盒（First Strand cDNA synthesis kit）合成cDNA第一链，参照说明书操作。 　　2.5.2 25 μL PCR扩增体系 DDH2O 14.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，β-actin