葛根素对人牙周膜干细胞成骨分化作用.docVIP

葛根素对人牙周膜干细胞成骨分化作用 　　[摘要]目的：探讨葛根素对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）成骨分化的影响。方法：向体外培养的hPDLSCs中分别加入0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作为实验组，另设阳性对照组和空白组。MTT法检测葛根素对hPDLSCs活性影响，采用免疫荧光法、碱性磷酸酶（alkaline phosphotase，ALP）试剂盒、茜素红染色及qRT-PCR对葛根素作用后hPDLSCs生物学特性作初步观察。结果：0.01mmol/L葛根素可明显促进hPDLSCs增殖，免疫荧光染色显示实验组I型胶原蛋白（collagen-I，COL-I）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）均阳性表达；与空白组对比，实验组诱导7天后ALP活性升高，14天后茜素红染色见矿化结节形成，qRT-PCR检测ALP和骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）分别在加药后7天和14天表达上调。结论：葛根素能够促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化。 　　[关键词]牙周膜干细胞；葛根素；成骨分化 　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）10-1067-05 　　众所周知，雌激素缺乏会增加患牙周病的危险度引起牙槽骨迅速吸收牙齿松动[1]。葛根素是从豆科植物野葛的干燥根中提取的一种异黄酮类化合物，可作为雌激素的替代药物发挥雌激素样作用[2]。文献报道葛根素能够促进脐带间质干细胞向成骨细胞分化[3]。人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）具有多向分化潜能，在适当的条件下，可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞及神经元样细胞[4]。本研究旨在探讨葛根素对hPDLSCs成骨分化的影响，为临床牙槽骨再生的防治提供新的思路。 　　1 材料和方法 　　1.1实验材料：葛根素（陕西天润生化有限公司，HPLC≥98%），二甲基亚砜、胎牛血清、α-MEM培养基、胰酶、Dispase酶、胶原酶（Gibco，美国），免疫磁珠、磁力架（Dynal biotech，美国），STRO-1单克隆抗体、CD146单抗、抗波形丝蛋白单抗、抗广谱角蛋白单抗、抗骨桥蛋白单抗（Novex，美国），抗I型胶原蛋白单抗、山羊抗鼠荧光二抗（Abcam，美国），山羊抗兔荧光二抗（Jackson，美国），地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、茜素红、MTT（Sigma，美国），ALP试剂盒（南京建成），DNAase试剂盒（Promega，美国），反转???试剂盒（Takara，日本），qPCR试剂盒（Roche，瑞士）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 hPDLSCs的分离和培养：在供者知情同意的前提下，收集12～16岁因正畸拔除的双尖牙，所选牙齿均无龋坏、根尖周疾病及牙周炎。参考以往的文献[5-6]，将新鲜拔除的牙齿在超净工作台内冲洗干净后，仔细刮取根中1/3的牙周膜组织，加入1ml 6mg/ml的胶原酶和1ml 8mg/ml的Dispase酶（此为四颗牙用量）混匀37℃水浴消化1h左右，1000rpm离心5min后弃上清，细胞重悬于10%胎牛血清的α-MEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）传至第三代，采用免疫磁珠法分离hPDLSCs：将约1×106/ml的hPDLCs与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠4℃孵育30min，在磁力架作用下筛选出STRO-1+hPDLCs并接种于6 孔板内，37℃、5% CO2的孵箱中培养。 　　1.2.2 hPDLSCs的鉴定：将筛选出的STRO-1+hPDLCs制备成细胞爬片，免疫荧光法进行STRO-1 、CD146、波形丝蛋白（Vimentin）及角蛋白（Cytokertin）染色，阴性对照以PBS代替一抗，荧光显微镜下观察。 　　1.2.3 MTT法检测葛根素对hPDLSCs活性的影响：将hPDLSCs按1×103/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后分别更换为含0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素的α-MEM培养基（每孔200μl），每组设5个复孔，同时设不含葛根素的空白对照组。继续培养24h后， 各孔加入MTT 20μl，置37 ℃、5% CO2培养箱培养4h，弃上清液， 每孔加入DMSO溶液150μl，混匀后用酶标仪检测其在570 nm 处的吸光度值。 　　1.2.4 葛根素对hPDLSCs成骨分化的影响 　　1.2.4.1 免疫荧光染色：分别取实验组培养7天和