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重叠PCR克隆Exendin—4基因及序列分析 　　[摘要] 目的 克隆Exendin-4 39肽氨基酸序列基因编码区cDNA。 方法 根据Exendin-4氨基酸序列编码cDNA，设计正、负向引物/模板链，利用重叠延伸PCR法扩增出Exendin-4编码区基因DNA片段；将获得的基因片段插入pGEM-T-Easy质粒中；转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆，利用限制性内切酶及核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。 结果 经质粒DNA酶切分析及序列测定，获得了Exendin-4 DNA片段序列。 结论 本研究成功克隆了Exendin-4 cDNA，为下一步构建Exendin-4真核表达载体打下基础，也为Exendin-4基因治疗糖尿病提供了前提条件。 　　[关键词] Exendin-4；重叠延伸PCR；基因克隆 　　[中图分类号] Q78 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（c）-0013-03 　　Exendin-4是胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体长效激动剂，具有与GLP-1相似的降血糖活性，目前已研发成为首个“模仿肠降血糖素”治疗2型糖尿病的药物——Exenatide[1-2]。但是Exenatide需每日注射，对糖尿病患者的治疗很不方便[3]，并且天然Exendin-4的提取成本高，难以满足临床应用需要[4]，用基因工程方法生产前景广阔。由于Exendin-4缺乏模板，本实验利用重叠延伸PCR技术扩增出Exendin-4目的基因编码区DNA片段，成功构建了Exendin-4表达载体，为进一步利用腺相关病毒载体构建表达Exendin-4及研究其在糖尿病治疗过程中的分子作用机制奠定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 质粒与菌株 　　克隆载体pGEM-T-Easy质粒（50 ng/μL）购自Promega公司；大肠杆菌TOP10、E. coli DH5α菌株由西安华广生物工程公司提供。 　　1.2 工具酶和主要试剂 　　限制性内切酶NaeⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ及TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶等试剂购自华美生物工程公司；质粒小提试剂盒、PCR纯化试剂盒、DNA回收试剂、Marker等均购自北京天根公司；引物合成及测序由上海生物工程有限公司完成；其他试剂及全部实验设备均由西安华广生物工程公司提供。 　　1.3 方法 　　1.3.1 重叠延伸PCR扩增Exendin-4 cDNA[3] 根据美国专利检索到Exendin-4 氨基酸序列是39个氨基酸（sequence 1 from patent US 5424286 39aa），应用DNASIS计算机软件分析Exendin-4的开放阅读框（ORF）和它的编码子，截取39肽的编码cDNA，设计正、负向引物/??板链，正向引物的5′端设计加入NaeⅠ酶切位点，负向引物的5′端加入终止子和BamH Ⅰ酶切位点。通过非对称互补引物/模板（重叠）聚合酶链式反应法获得完整的Exendin-4，首先P1和P2互为引物和模板进行PCR扩增Exendin-4 cDNA核心区，以第1次PCR产物为模板，P3、P4为引物合成完整的Exendin-4，且分别在引物P3、P4中引入NaeⅠ和BamHⅠ酶切位点和终止子。引物序列见表1。PCR反应体系：在100 μL反应总体积中，加入1 μL （0.1 mg/L）DNA模板，1 μL （50 μmol/L）上游引物，1 μL （50 μmol/L）下游引物，2 μL（10 mmol/L） dNTPs，10 μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液，80 μL消毒去离子水，最后在体系表面加50 μL石蜡油；沸水中煮5 min后，立即冰浴2 min，加1 μL（1 U/μL）TaqDNA聚合酶入反应体系。扩增条件如下：94℃预变性1 min，进入94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃延伸5 min，32个循环；取扩增产物10 μL进行1%琼脂糖电泳，观察电泳结果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳法回收，正丁醇浓缩，酚∶氯仿抽提，无水乙醇沉淀；将沉淀溶于20 μL TE （pH 8.0），4℃保存备用。 　　1.3.2 Exendin4 cDNA 的T载体克隆和序列测定 将PCR产物连接到线性克隆载体pGEM Teasy中，转化Top10受体菌，氨基苄青霉素筛选阳性克隆，碱裂解法小量提取质粒，限制性内切酶EcoRⅠ酶切图谱鉴定。连接反应体系如下：①用T4 DNA连接酶连接质粒pGEM-Teasy和PCR产物，10 μL反应体积中加入1 μL（50 mg/L）载体DNA，3 μL（0.5 g/L） PCR产物，5 μL 2×T4 DNA连接酶缓冲液，60℃水浴5 min，冰浴2 m