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降钙素基因相关肽介导骨折愈合实验研究 　　[摘要] 目的 研究降钙素基因相关肽（CGRP）对骨折愈合的作用。 方法 36只SD大鼠随机分为A、B、C 3组，每组12只，制备右下肢股骨干骨折模型。A组注入重组的pcDNA3.1-CGRP质粒溶液；B、C分别注入单纯pcDNA3.1质粒溶液和磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照。分别于2、4周后观察骨折愈合情况和CGRP的表达水平。 结果 术后2周时，A组动物骨折端有骨性骨痂形成，B、C组未见形成；A组CGRP蛋白相对量（0.438±0.026），明显高于B组（0.186±0.009）、C组（0.173±0.011），差异有统计学意义（P 　　[关键词] 骨折；降钙素基因相关肽；基因重组；质粒转染；愈合 　　[中图分类号] R68 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2013）09（b）-0164-03 　　骨折是骨科临床中最为常见的疾病，特别是随着交通事故的频发，骨折患者的数量也呈逐年上升的趋势。目前，骨折的治疗方式主要包括切开复位和闭合复位，但无论哪种方式都存在延迟愈合甚至不愈合的可能，给患者的身心造成极大的痛苦。针对这一问题，国内外学者先后采用了机械固定、骨移植、电刺激、骨诱导等多种方法进行治疗[1-3]，虽然取得了一定的进展，但均不能完全解决骨折不愈合的难题。本研究采用与骨代谢密切相关的降钙素基因相关肽（CGRP）转染入骨折断端，观察其对骨折动物模型的愈合作用，在基因水平为促进骨折的愈合提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　36只SD大鼠，平均体重（200±10）g ，由中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK（黑）2006-032；pcDNA3.1-CGRP质粒（Invitrogen，美国），E.coli. DH5α（哈尔滨医科大学附属第四医院实验室提供），CGRP引物、dNTP（TAKARA，日本），Hind Ⅲ、BamHⅠ（博士德公司，中国武汉），兔抗大鼠CGRP单克隆抗体、生物素二抗、AP二抗（博士德公司，中国武汉）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 pcDNA3.1-CGRP质粒的转化 应用CaCl2溶液将E.coli. DH5α制备成感受态E.coli. DH5α，加入到50 mL离心管中，向离心管中加入5 μL pcDNA3.1-CGRP质粒，冰浴30 min，42℃热休克90 s，再冰浴2 min。向管中加入SOC培养基800 μL，37℃培养45 min，使恢复大肠杆菌的正常生长状态并且表达抗生素的抗性基因。将菌液涂于含有50 μg/mL氨苄青霉素的SOB平板上进行抗性筛选。 　　1.2.2 CGRP的PCR及酶切鉴定 待菌落长出后，挑选饱满菌落对CGRP行PCR检测，向体系内加入5×PCR Buffer 4 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各1 μL（表1），Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O定容至20 μL。95℃变性60 s，60℃复性60 s，72℃延伸60 s，30个循环后，72℃延伸5 min，4℃保温。对产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。对于PCR鉴定阳性菌落，扩增提取质粒后，加入10×K Buffer 2 μL，Hind Ⅲ 1 μL，BamHⅠ1 μL，质粒-PCR混合物15 μL，ddH2O定容至20 μL，37℃反应8 h后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。 　　表1 聚合酶链反应引物列表 　　注：CGRP：降钙素基因相关肽；GAPDH：内参基因；“-”代表无内切酶 　　1.2.3 pcDNA3.1-CGRP质粒溶液的配制 选取pcDNA3.1-CGRP鉴定为阳性克隆菌株，扩增后应用QIAGEN Plasmid Midi Kit提取质粒，0.22 μm滤器除菌干燥后加入到含20%蔗糖的PBS溶液中，配制成浓度为1.0 g/L的pcDNA3.1-CGRP质粒溶液，同时配制1.0 g/L的单纯pcDNA3.1质粒溶液，-20℃保存待用。 　　1.2.4 动物的分组及模型制备 36只SD大鼠随机分为A、B、C 3组，每组12只，3.5%水合氯醛（1 mL/100g）腹腔麻醉，右下肢常规备皮消毒后，切开皮肤及皮下组织，分离暴露股骨，于股骨中点处用摆锯将股骨横行锯断，克氏针固定后逐层缝合。术后24、48 h两个时间点，A组每只动物于骨折处经皮注入pcDNA3.1-CGRP质粒溶液1 mL，B组注入单纯pcDNA3.1质粒溶液1 mL，C组注入PBS溶液1 mL作为阴性对照。于术后2、4周检测骨折愈合情况。 　　1.2.5 骨折端的X线检查 于术后观察大鼠一般状态及切口情况，对每组动物均进行X线检查，记录骨折复位情况。分别在2、4周时每组分别选取6