雌激素受体与Ⅱ型胶原在人胚髁突软骨中表达.docVIP

雌激素受体与Ⅱ型胶原在人胚髁突软骨中表达 　　[摘要] 目的 探讨雌激素受体（ER）和Ⅱ型胶原在人胚髁突软骨中的表达情况。方法 采用苏木精-伊红（HE）及免疫组织化学染色法检测ERα、ERβ和Ⅱ型胶原在人胚颞下颌关节髁突软骨各层的表达。结果 Ⅱ型胶原主要表达于髁突软骨的过渡层及肥大层。ERα主要表达于髁突软骨的过渡层及肥大层，均匀分布于细胞内；ERβ集中表达于肥大层，且以细胞核内分布为主。纤维层及增殖层未见Ⅱ型胶原和ER表达，钙化软骨层有少量表达。结论 ER与Ⅱ型胶原在髁突软骨中分布一致，雌激素可选择性地结合不同亚型的ER，从而调节髁突软骨细胞分泌Ⅱ型胶原的能力。 　　[关键词] 髁突软骨； 雌激素； 雌激素受体； 人胚 　　[中图分类号] R 322.4+1 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.020 　　大量的临床病例和流行病学调查表明，雌激素水平的变化可能是导致颞下颌关节紊乱病（tempo-romandibular joints disorders，TMD）的重要原因之一。雌激素发挥生理作用需要雌激素受体（estrogen receptor，ER）的介导，既往研究显示，动物和人的关节均有雌激素受体的表达，证明关节是雌激素作用的靶器官。颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）的结构与功能复杂，并且终生进行适应性改形重建，雌激素对TMJ的效应是否与其他关节相同，目前尚不明确。本研究应用苏木精-伊红（hematoxy-lin-eosin，HE）及免疫组织化学染色法观察ER以及间质胶原在人胚髁突软骨中的表达，并分析两者的重叠关系，以期为TMD的发病机制研究以及临床合理应用雌激素治疗TMD提供理论和实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验标本、试剂及仪器 　　髁突软骨取自因母体健康原因水囊引产并自愿捐献的4～5月龄胚胎。ERα多克隆抗体、ERβ多克隆抗体、柠檬酸钠抗体修复液（北京博奥森生物技术有限公司），鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体、通用型二步法免疫组织化学检测试剂盒、山羊血清封闭液、胃蛋白酶消化液、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），倒置相差显微镜（Olympus IX71）、Image-Pro Express6.0成像系统（Olympus公司，日本），自动显微照相装置（Qimaging公司，加拿大）。 　　1.2 髁突软骨ΗΕ染色 　　软??切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化组织切片。苏木精染色4 min，流水冲洗多余染液。1%盐酸乙醇分化5 s，流水冲洗，40 ℃温水返蓝10 min。伊红染色30 s，流水冲洗。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，风干，中性树胶封固。 　　1.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色 　　髁突软骨切片分成2组，常规脱蜡水化，滴加3%过氧化氢避光孵育15 min，胃蛋白酶消化30 min，山羊血清封闭30 min，滴加鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体（一抗，即用型）及PBS作为阴性对照组，4 ℃孵育过夜，滴加通用型二抗，DAB显色，常规封固拍照。 　　1.4 ER免疫组织化学染色 　　髁突软骨切片分成3组，常规脱蜡水化，滴加3%过氧化氢避光孵育15 min，柠檬酸钠抗原热修复两次，山羊血清室温封闭30 min，分别滴加ERα多克隆抗体（一抗10 μg·mL-1）、ERβ多克隆抗体（一抗10 μg·mL-1），滴加PBS作为阴性对照组，4 ℃孵育过夜，滴加通用型二抗，DAB显色，常规封固拍照。 　　2 结果 　　2.1 人胚髁突解剖形态观察 　　4～5月龄胚胎下颌骨呈粉白色，透光可见红色骨髓，骨质较薄韧性尚存，未完全骨化。下颌体与下颌升支相交呈钝角，下颌升支分成喙突与髁突，两突相交呈“U”形，在乙状切迹处汇合。髁突内外径大于前后径，颈部短小，表面覆盖中央凹陷的关节盘，后斜面大于前斜面，位置略高于前斜面（图1）。 　　图 1 人胚髁突 　　Fig 1 Mandibular condylar cartilage of human embryo 　　2.2 人胚髁突软骨HE染色观察 　　髁突软骨从关节表面至深层可分为5层。纤维层：9～11层细胞，细胞核染成蓝色，呈卵圆形或梭形；增殖层：5～6层小而密集的细胞，细胞形态从细长三角形逐渐演变成扁平三角形；过渡层：5～7层，呈扁平三角形或椭圆形的细胞；肥大层：10～ 　　11层软骨细胞；钙化软骨层：12～13层细胞，接近骨组织处，细胞体积最大，细胞质呈空泡状，细胞核染成蓝色位于中央，不规则地皱缩呈椭圆形或三角形（图2）。 　　F：纤维层；P：增殖层；T：过渡层；C：肥大层；K：钙化软骨层。 　　图 2 人胚髁突软骨 HE × 100 　　Fig 2 Mand