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雌激素对人胚髁突软骨细胞增殖分化影响 　　[摘要] 目的 观察不同浓度的雌激素作用于体外培养的人胚髁突软骨细胞（MCCs），探讨雌激素对MCCs增殖分化的影响。方法 体外培养MCCs，甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色法鉴定；甲基噻唑基四唑（MTT）法检测不同浓度雌激素对MCCs增殖与分化的影响。结果 高浓度（10-6 mol·L-1）、低浓度（10-12 mol·L-1）雌二醇抑制MCCs增殖分化，生理浓度（10-10、10-8 mol·L-1）雌二醇促进MCCs增殖分化，且随作用时间延长，促进或抑制作用增强。结论 雌激素对体外培养的人胚MCCs增殖分化具有双向调节作用，呈时间和剂量依赖性。表明雌激素对维持颞下颌关节的正常功能具有重要意义，可能在颞下颌关节病的发生和进程中发挥作用。 　　[关键词] 髁突软骨细胞； 雌激素； 增殖； 人胚 　　[中图分类号] Q 254 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.020 　　颞下颌关节紊乱病（temporomandibular joints disorder，TMD）是口腔颌面部常见病、多发病，病因复杂[1-2]。流行病学调查显示，其发病存在明显的性别差异，以女性高发，且患病集中在青春期和绝经期[3-4]，推测雌激素与TMD的发病可能有一定关系。髁突软骨细胞（mandibular condylar chondro-cytes，MCCs）具有类似间充质细胞的作用，其增殖分化直接调节细胞外基质的合成与降解。既往动物实验表明，雌激素影响长骨和颞下颌关节软骨的增殖分化[5-7]，而探究雌激素对人MCCs作用的报道甚少。本研究选用17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）干预体外培养的人胚MCCs，从而了解雌激素对人胚MCCs生长代谢的影响，为进一步揭示雌激素与TMD的作用机制提供实验基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验材料、试剂及仪器 　　1.1.1 标本 选取遵义医学院附属医院计生科提供的因母体健康原因水囊引产并自愿捐献的4～5月龄胚胎。实验通过伦理委员会批准和同意。 　　1.1.2 实验试剂和仪器 鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体、通用型二步法免疫组化检测试剂盒、山羊血清封闭液、胃蛋白酶消化液、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），改良的高糖Eagle培养基（high glucose Dulbecco’s modified Eagle medium，HG-DMEM）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），Ⅱ型胶原酶、E2（Sigma公???，美国），胎牛血清（fe-tal bovine serum，FBS）（Hyclone公司，美国）。 　　倒置相差显微镜（IX71）、Image-Pro Express6.0成像系统（Olympus公司，日本），二氧化碳培养箱（Forma公司，美国）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 人胚MCCs的原代培养与纯化 无菌条件下取出双侧髁突，仔细剥离去除髁突软骨表面的纤维组织，切取呈半透明的软骨中间部分，PBS清洗，反复剪切至1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃振荡消化30 min；37 ℃ 0.1%Ⅱ型胶原酶消化2 h，150目筛网过滤，用含20%FBS的HG-DMEM调整细胞浓度至每毫升5×105个，然后接种于25 cm2培养瓶中培养，观察并记录细胞生长状况。生长至第8天时，差速贴壁3次去除成纤维细胞，纯化后计数细胞浓度为每毫升5×105个时接种于25 cm2培养瓶中。 　　1.2.2 人胚MCCs传代培养及细胞爬片制备 原代细胞达到70%～80%融合时，胰蛋白酶消化收集细胞，用含10%FBS培养基制成浓度为每毫升5×105个的细胞悬液接种于25 cm2培养瓶，每3 d更换1次培养液。收集第1代细胞，加培养基调整细胞浓度为每毫升 　　5×104个，接种于已预先放置灭菌处理盖玻片的六孔板中。细胞60%融合时，固定于载玻片上。4%预冷丙酮中固定15 min，PBS漂洗，4 ℃保存备用。 　　1.2.3 人胚MCCs的形态学观察 取已制备好的MCCs爬片，PBS漂洗，苏木精染色4 min，1%盐酸乙醇分化2 s，流水冲洗，温水返蓝后，伊红复染3 min，常规脱水、透明后中性树胶封固。 　　1.2.4 人胚MCCs的鉴定 1）甲苯胺蓝染色：PBS漂洗细胞爬片，0.1%甲苯胺蓝染色15 min，水洗10 min，常规脱水、透明后中性树胶封固。2）Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色：在细胞爬片上，滴加0.3%Triton-X100作用20 min；再滴加3%过氧化氢避光孵育15 min，胃蛋白酶室温消化20 min，山羊血清室温封闭30 min；滴加鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体（一