通过放空阀排出气泡.PPT

* 解决上述问题的方法： HPLC生产者应该采取的正确做法：泵、柱、检测器三者联起来检验，三者同时入库（编号），三者成套出售。这样才能保证仪器在用户那里的质量。 2、使用者应该对色谱柱及柱外的有关 问题引起高度重视 （制造者在制造过程中也应该重视） 1）色谱峰拖尾：与柱、流动相的流速、试样等有关，发现拖尾一定要从这些方面查找原因； 2）如何延长色谱柱寿命：保养很重要，长期不用时用甲醇浸泡着；严格控制洗柱时间或溶剂体积；一般经常使用的柱，下班时应该洗 45分钟或洗20倍床体积的溶剂； 3）必须注意对“柱外效应”的控制： 所谓“柱外效应”,就是指HPLC系统中，除柱系统外，管路、连接件、进样器和流动池的死体积等引起的色谱峰增宽效应。 4) 进样： 自动进样时，应该经常检测自动进样器；对仪器的进样器要求稳定可靠；手动进样时，应该特别注意取样时的细节；进样时的手感（轻、重、缓、急）等。 3、HPLC的研发制造者和使用者应该 特别注重对色谱柱质量的判断 1）色谱柱的柱效：塔板数高者好；特别要 注意影响柱效的因素；塔板数降到一 定程度该柱就报废了。 2）重复性：一根柱子反复使用时，最好 RSD能够保持小于0.1%。 3）耐用性(寿命)：因为柱效很容易降低， 所以需要重视对柱的保护。 4）色谱柱使用后一定要进行清洗 ，以免 造成腐蚀、阻塞、降低塔板数。一般应该用20倍床体积的溶剂冲洗；隔几天再用的HPLC，最好用20%甲醇：80%水冲洗30分钟左右后，再用纯甲醇冲洗20分钟 后保存[2]。 4、HPLC的研发、制造、使用者应该 特别重视流动相问题 1）PH值特别重要：一般的C18柱在PH值 小于3时，容易损坏色谱柱。但是抗酸 性的柱可以使用小的PH值。 2） 注意选择试剂的截止波长[2] ：如乙腈 215截止波长215nm、丙酮截止波长 330nm、正丁烷210nm等。 3）流速：流速要适当，否则影响峰形、浪 费溶剂；一般常规分析工作大多选择 1ml/min 。 5、使用者应该注重溶剂前处理 最好使用HPLC级的优质溶剂；使用前必须过滤和脱气。注意以下几点： 1）过滤目的： 溶剂进泵前和样品注射前应该过滤除去溶剂中的微小颗粒、微生物，保证泵和色谱柱不会堵塞或损坏，保证分析数据可靠。 2）对过滤器的要求和最佳孔径选择方法： 对过滤器总的要求：速度快、溶出度小、死体积小、精确的孔径、体积适当、化学兼容性好等。 最佳孔径选择方法：如果色谱柱填料直径小于3μm或除菌过滤，一般选择0.2μm孔径；如果色谱柱填料直径大于5μm，则选0.45μm；如果是预过滤或过滤难过滤的样品，一般选1μm孔径。特别是对使用无机盐配制的缓冲液，更要注意选择合适的过滤器！否则，不可能得到可靠的分析测试数据！ 3）脱气： 主要目的是：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 ；液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。流动相的气泡进入液相泵会引起压力的上下波动，危害很大。必须除之；可以打开排空阀，大流速冲洗。 6、使用者应该注重缓冲液问题 1） 缓冲液使用前必须过滤 2） 溶剂、样品易受到细菌和霉菌的影响， 要注意清洁。 3）一般不能直接用有机溶剂做清洗冲洗。 4）梯度洗脱时，选低吸收值的缓冲液 ： 例如：梯度洗脱时，缓冲液与有机相应预混，以防止析盐；在保证峰不拖尾的情况下，尽可能选用低浓度的缓冲盐，防止析盐； 缓冲盐浓度，一般用20～30mM基本上就可以了，如果流动相中有机相含量高的话，流动相中的盐类缓冲液浓度就不能过高，盐的浓度起码要保证在流动相条件下不会析出。离子对缓冲液浓度要高一点，一般50～100mM。 7、检测器问题 1）最常用的检测器主要有四种（紫外、荧光、光 蒸发散射和质谱）;紫外检测器覆盖面约70%；荧光检测器覆盖面约12%；蒸发光检测器（包括示差折光检测器）覆盖面约8%左右；质谱8%左右；其它2%）。紫外检测器的波长问题：一般固定254nm或可变波长被常用；但是可变波长较好； 2）噪声：直接影响分析误差；应该经常检测之； 3）漂移：它是影响稳定性的主要内容内容之一 ； 4）灵敏度（或检测限）：应该经常自己检测，保 证HPLC系统的检测限； * 现象 原因判断 排除方法 （1） 压力过高 色谱柱柱头被堵塞；色谱柱性能下降或柱有一定堵塞； 加保护柱；或换柱或冲洗柱 在线式过滤器堵塞； 用30%的稀硝酸，放在