肿瘤的分子诊断课件.ppt

肿 瘤 的 分 子 诊 断 器官病理学 组织病理学 细胞病理学 免疫病理学 分子病理学 应用分子诊断技术，对肿瘤发生发展的病理学机制及生物学行为能从分子水平上加以认识，其范围覆盖分子生物学和细胞生物学。研究较为深入当属癌基因、抑癌基因及其它相关基因。 第一节 肿瘤基因过表达及其检测 一、基因过表达的形式 癌基因一般为单拷贝基因，有其编码的蛋白质，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA复制过程中形成多个拷贝，形成双微粒染色体和均染区，各种基因的扩增常产生基因产物过表达，表现为RNA和蛋白质量的增加。 二、基因过表达的检测 （一）表达产物的检测 免疫组织化学（immunohistochemistry） 酶联免疫吸附实验 （enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA?） 蛋白印迹（Western blot） 流式细胞仪测试法 （二）基因扩增的检测 基因拷贝数的增加和转录产物的mRNA 的增加 分子诊断检测方法: 原位杂交 （in situ hybridization,ISH） 荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization, FISH） 原位PCR（in situ polymerase chain reaction） Southern杂交（DNA杂交） Northern杂交（RNA杂交） 原位杂交（in situ hybridization,ISH） 将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，属固相核酸分子杂交范围，它用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特异的DNA或RNA序列。 优点： 1、具有分子杂交的特异性强、灵敏高特点，同 时又具有组织细胞化学染色的可见性； 2、即可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回 顾性研究； 3、所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞 涂片； 4、应用范围广泛，可对特定的基因（如癌基因、 病毒基因）DNA、mRNA的表达进行定位、定 性和定量。组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞 定位研究。 分类： DNA-DNA杂交 DNA-RNA杂交 RNA-RNA杂交 直接法 间接法 同位素标记 非同位素标记 生物素、地高素、荧光素等 双重标记原位杂交技术 荧光原位杂交（FISH） 将荧光素标记克隆的DNA片段与染色体或细胞间期染色质杂交，以测试该特定的DNA片段是否有缺失或扩增。 比较基因组杂交 （comparative genome hybridization CGH） 即将荧光素分别标记在去除了重复序列的肿瘤及正常细胞基因组DNA上，然后分别与正常染色体进行原位杂交，对该二种不同探针与各个染色体杂交后的信号进行比较，以了解该肿瘤中细胞在不同染色体上缺失或扩增的状态。 原位PCR （in situ polymerase chain reaction） 将PCR扩增技术和原位杂交技术相结合，通过PCR技术对靶核苷酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使基因拷贝数放大，再通过原位杂交方法检测，以达到对靶核苷酸进行定性、定位、定量分析。 一种敏感性高、特异性强，能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定性的研究方法。 Southern杂交： 一种DNA特定序列定位技术。 以组织或细胞中获取基因组DNA，用一种或多种限制性内切酶酶切，通过电泳、转印、原位变性固定于一固相支持物，用已标记的特异性DNA或RNA的探针与固定有DNA的固相支持膜杂交，经过放射自显影或化学发光自显影，对显影条带进行分析。 Northern blot： 用于分析细胞总RNA或含有poly A尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，可了解被测靶基因在细胞内有无过表达。 注意问题： 1、提取组织或细胞中的RNA，不需酶切而直接采用电泳。 2、操作过程要严格控制RNase的污染。 3、RNA只与双链DNA样本中的一条链互补，因此杂交时所需双链DNA探针的量加大；如采用单链探针，无论是DNA抑或RNA探针，或是寡核苷酸探针，均需确定所用探针能与目标RNA互补。 第二节 基因突变及其检测 癌基因和抑癌基因突变是肿瘤发生中出现频率较高的分子事件，突变的结果则使癌基因激活或抑癌基因失活，导致细胞表型发生