深部真菌感染实验室诊断评价（四川大学华西医院范红）课件.ppt

深部真菌感染实验室诊断评价 范 红 四川大学华西医院 呼吸/微生物检验 IFI危险因素 IFI感染率上升 IFI感染率上升 真菌感染诊断方法 显微镜检查 培养 血清学 分子生物学 镜检和培养 敏感性低 血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。 培养结果阳性: 仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难 真菌学检查：培养＋涂片镜检 组织病理检查（PAS、银染） 侵袭性肺部真菌感染诊断—微生物学 分子生物学技术在IFI中的应用 限制性片段长度多态性分析（RFLP） 最初用于感染性疾病诊断的分子生物学方法之一 需要从培养生长的病原体中提取DNA，适用于真菌的菌种鉴别和分析真菌的传播途径，而不适合IFI的临床诊断 PCR方法 目前采用的主要分子生物学方法 已对曲霉、假丝酵母菌、组织胞浆菌、肺孢子菌等真菌感染的诊断进行了较多的研究，有一定的临床应用价值 实时PCR（real-time PCR，RT-PCR） 基因扩增和产物检测在一单管装置中进行，不需要凝胶电泳，因而简化了操作过程、减少了实验室污染的机会 可定量测定基因扩增产物，通过确定合适的阈值有望作为分别判断IFI与定植的方法之一 最有前途的分子生物学技术 分子生物学技术在IFI诊断中的应用评价 分子技术与常规的诊断技术相比的优劣 优点：更快捷、敏感性较高，能快速鉴定耐药菌，受抗真菌药物治疗的影响小，并能检测出标本中无活力的真菌。 缺点：费用高，操作过程较复杂，标本中存在的PCR抑制物时可引起假阴性而真菌定植和污染可导致假阳性结果，各实验室之间检测结果的的差异较大。尚需系统的临床评价 PCR：ITS、IGS 真菌的基因数据库并不完整 Genebank中~30%真菌序列是错的！ 形态学仍然非常重要！ PCR技术与BDG、GM或其他抗原检测的联合应用，可能是将来的发展方向 我们的应用体会 种属鉴定对于临床治疗非常重要! 合理应用和解释G-test/GM 临床沟通很重要！ 动态监测 真菌标本直接涂片的诊断价值 诊断阳性率高 BALF培养阳性率40％，涂片64％，涂片＋培养67％ (Ann Intern Med 1997, 29: 535; Respir Med 1992, 86:243) 快速：1~2h可以报告结果 有助于鉴别感染类型 有隔菌丝，45°分枝：曲霉菌属 无隔宽大菌丝： 结合菌纲 关节孢子：毛孢子菌属、地霉属等 经常是唯一诊断依据！ 37th热病-丝状真菌体外敏感性 确诊依据： 组织病理检查（PAS、银染） 真菌学检查：培养＋涂片镜检 必须是血液或正常无菌腔液标本培养阳性 检测方法 直接镜检的局限性 阴性结果不能排除真菌感染 敏感性低于培养法 （随标本类型、数量采集时间和质量而不同） 有假阳性结果（误认） 酵母型和二相型真菌在组织内常为孢子 血培养结果阳性是确诊的依据，但须注意 如果培养结果为曲霉或青霉（除外马内菲青霉）生长时应结合临床进行判断 需要谨慎排除标本污染的可能 特别需要仔细分析 首先保证采集合格的痰标本 痰培养的阳性率非常高，尤其白色念珠菌培养阳性 BAL培养结果的可靠性要高于痰 以往我国诊断标准对临床的影响 2001我国卫生部“医院感染诊断标准（试行）”的具体诊断标准： 1.在原发病的诊治过程中出现呼吸系统症状和体征、发热、白细胞增加； 2.х线胸片出现不能解释的片状或团块状阴影； 3.影像学提示有肺部病变，应用抗生素治疗过程中病情恶化，用一般细菌感染不能解释； 4.连续３次深部痰培养为同一种真菌； 5.血、尿、便培养为同一种真菌。 呼吸诊治原则中IPFI微生物学诊断 痰和BAL检查的诊断意义 痰和BAL检查的诊断意义 美国感染性疾病学会－2009年指南：慢性播散性念珠菌病和呼吸道分泌物中分离出念珠菌的推荐治疗 目前接受的有三种： 曲霉GM检测（半乳甘露聚糖） 真菌G试验（1-3-β-D葡聚糖） 隐球菌夹膜多糖抗原 What is G试验？ 可检测多种致病真菌感染 念珠菌,曲霉,肺孢子菌,镰刀菌,地霉,组织胞浆菌,毛孢子菌等 不能用于检测隐球菌和接合菌（根霉、毛霉等）感染 BDG检测 1,3-β-D-葡聚糖（1,3-beta-D-glucan，BDG） 由D-葡萄糖聚合而成，以β（1→3）糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分枝状β（1→6）糖苷键连接的葡萄糖残基作为侧链 广泛存在于除接合菌外的真菌细胞壁中，占真菌细胞壁成分的50%以上，在酵母菌中含量最高，其他微生物如细菌、病毒，以及动物、人体细胞均无此成分 BDG检测原理 能特异性激活自鲎变形细胞溶解