生化课件抗原抗体的纯化.ppt

第三章 抗原抗体的纯化 免疫教研室 曾瑞红 抗原的纯化是制备高效价、高特异性抗体的先决条件； 抗体的纯化对提高免疫反应的特异性和敏感性、定量检测抗原极为重要。 根据抗原抗体的来源、研究目的、结构等的不同，其分离方法也多种多样。 第一节 离心分离法 第二节 沉淀分离 第三节 离子交换层析法 第四节 凝胶层析 第五节 亲和层析法 第六节 电泳 第一节 离心分离法 离心分离法是根据物质的沉降系数、浮力、质量、颗粒大小等方面的差异，利用强大的离心力场，使其分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。 一、基本原理 （一）离心力 F= mω2r =mr(2π N/60)2 m:沉降固体颗粒的有效质量(g) r: 离心半径,转子中心轴到沉降颗粒之间的距离; N：离心机每分钟的转数 沉降系数 单位离心力作用下的沉降速度为沉降系数(s)。 s乘1013定义为一个沉降系数单位（S），常用S表示生物大分子的大小，如：RNA 5S,18S. 离心机 离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。 转头可分为：水平转头,角度转头，垂直转头。 二、离心方法的类型 （一）差速离心 采用不同的离心速度和离心时间，用不同的离心力，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。 如:离心前盛在离心管内的是含有大、中、小三种颗粒的悬浮液 (a)先低速离心，得到的沉淀主要是最大的颗粒 (b)进一步提高转速离心上清液，得到主要由中等大小颗粒组成的第二种沉淀； (c)最后一步用更高转速把余下的小颗粒沉淀下来。 其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②管壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活 （二）密度梯度离心（区带离心法） 是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。 密度梯度介质：蔗糖、甘油等。作用：支撑样品和防止离心过程中产生的对流将已形成的区带破坏。 最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度。 离心时间不能过长，必须在沉降速率最大的样品区带沉降到管底之前停止离心，否则样品中所有组分都将沉降下来。 步骤：在离心前于离心管内先装入密度梯度介质溶液（从管顶到管底密度逐渐增加），将样品小心铺在介质的表面，经过离心，样品中各组分在密度梯度溶液中形成若干条界面清晰的不连续区带。 该法的优点是：①分离效果好，S值相差较小的组分也能得到很好的分离；②颗粒不变形，能保持颗粒活性。 缺点： ① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严格，不易掌握。 （三）等密度梯度离心 指当待分离不同颗粒的密度范围处于梯度介质的密度范围内时，在离心力的作用下，不同密度的颗粒向上漂浮或向下沉降，经足够时间的离心，移动到与它们各自的密度相等的位置，形成组分区带。 常用介质溶液：绿化铯（ CsCl）等铯盐。 步骤：将介质溶液与样品混合，离心，铯盐沉降自动形成密度梯度，颗粒在梯度中进行再分配，在等密度处形成区带。 三、影响因素 1、离心速度：低速离心一般用转子每分钟的转数表示，500r/min,高速离心和超速离心一般用相对离心力（RCF）表示，如:500×g。 RCF指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。 2、离心时间:不能过长或过短。 常速离心、高速离心和差速离心的离心时间是指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时间。 密度梯度离心的离心时间指形成界限分明的区带时间，即区带形成时间。 等密度梯度离心的离心时间指颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。 3、温度：室温，4 ℃，高速离心和超速离心必须冷冻离心。 4、pH：离心介质的pH必须处于待分离物质稳定的pH范围内，可采用缓冲液。 四、应用 分离生物大分子 第二节 沉淀分离 沉淀分离法是通过改变溶液的条件或添加某种物质，降低溶液中某一成分的溶解度，使其从溶液中沉淀析出，与其他成分分离的技术。 一、盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。 （一）原理 ①盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降； ②盐离子所带电荷的中和部分蛋白质分子表面电荷，使蛋白质溶解度下降。 （二）盐类和浓度的选择 中性盐：（NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl，其中运用最广的是（NH4)2SO4硫酸铵。 硫酸铵的优点：在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数