第4章蛋白质的化学ppt课件.ppt

第五节 蛋白质的性质 一、蛋白质分子的大小、形状及分子量的测定 分子量＞10000 蛋白质； ＜ 10000 多肽 P87 胰岛素分子量为5437，习惯上称为蛋白质 形状：根据其不对称常数，将蛋白质分为球形、椭圆 形、纤维状 分子量测定常用方法： ①分子筛层析法 ②SDS-聚丙烯凝胶电泳（SDS） ③生物质谱 ①.分子筛层析法测定蛋白质分子量大小 凝胶颗粒 收集蛋白质管 蛋白质混合物 大分子 从柱上面加缓冲溶液 小分子 洗脱体积（Ve） 凝胶柱 大分子 小分子 Ve1 Ve2 V0 ②. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量大小 3.生物质谱（MS）测定蛋白质分子量大小 二、蛋白质的变性 某些理化因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变的现象。 变性的本质 —— 破坏非共价键和二硫键， 不改变蛋白质的一级结构 变性作用的因素 物理因素：高温、紫外线、X-射线、超声波、剧烈振荡等 化学因素：强酸、强碱、尿素、去污剂、重金属、三氯醋酸、浓酒精等 变性作用的意义 变性的特征： 生物活性的丧失 某些理化因素 的改变 溶解度降低，易沉淀 不对称性增加 粘度增加 扩散系数降低 分子结构松散，易被水解 天然状态，有催化活性 尿素、 β-巯基乙醇 去除尿素、 β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性 三、蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。 等电点（pI） 在某一pH的溶液中，蛋白质所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。 CH NH2 COOH R pH=pI +OH- pHpI +H+ NH3+ COO- CH NH2 COO- R +OH- +H+ pHpI CH COOH R NH3+ 蛋白质的兼性离子 阳离子 阴离子 R CH 四.蛋白质的胶体性质 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 － － － － － － － － 带负电荷的蛋白质 水化膜 水化膜 蛋白质形成亲水胶体的因素： ①蛋白质表面有水化层 ②蛋白质表面具有同种电荷 五、蛋白质的沉淀反应 蛋白质分子从溶液中析出的现象，称为蛋白 质的沉淀。 1.中性盐沉淀：硫酸铵、氯化钠 2.有机溶剂沉淀反应：乙醇、苯酚 3.加热沉淀反应： 4.重金属盐沉淀反应：重金属中毒 5.生物碱试剂：药检（三氯醋酸） 六、蛋白质的颜色反应 P93 1.茚三酮反应：氨基 2.双缩脲反应：肽键 3.酚试剂反应：酪氨酸、 色氨酸 七、蛋白质的免疫学性质 1.抗原，抗原性 2.抗体 单克隆抗体 多克隆抗体 3.蛋白质免疫性质的应用 免疫预防：疫苗 免疫、诊断治疗 二、蛋白质的分离与纯化 利用不同蛋白质溶解度不同、分子大小不同、电离性质不同、配基特异性不同确定使用不同的纯化方法 （一）利用溶解度不同的分离纯化方法 1.等电点沉淀 2.盐析沉淀 3.低温有机溶剂沉淀法 4.温度对蛋白质溶解度的影响 0-40℃之间，大部分蛋白质溶解度随温度升高而增加，40-50℃以上开始变性而沉淀。因此蛋白质分离一般在0℃或更低的温度下进行。 超过滤 加压 蛋白质溶液 半透膜 支持膜的栅板 超滤液 半透膜袋 蛋白质溶液 透析液 磁棒 磁力搅拌器 透析 （二）根据分子大小不同的分离纯化方法 1.透析和超过滤 2.凝胶过滤 3.密度梯度离心 2.分子排阻层析 未知 logMr 洗出液中的蛋白质浓度 洗脱体积（mL） 层析的主要设备 3.密度梯度离心法 滴加样品 蔗糖密度梯度 蔗糖浓度 CsCl密度梯度离心 （三）根据电离性质不同的分离纯化方法 1.电泳法：带点质点在电场中向电荷相反的方向移动。 ①醋酸纤维膜电泳 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③等电聚焦电泳 ④免疫电泳 ⑤二维电泳 2.离子交换层析：离子交换纤维素、 离子交换凝胶、 大孔型离子交换树脂 等电聚焦电泳 2.离子交换层析分离蛋白质 蛋白质浓度 洗脱体积 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质 收集样品的管 收集样品的管 带负电荷的蛋白质 蛋白质混合物 玻璃柱 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质 带正电荷的蛋白质 收集样品的管 NaCl NaCl梯度 （五）利用配体的特异性