蓝白斑筛选_1课件.ppt

蓝白斑筛选 蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验） 乳糖：乳糖操纵子的天然诱导物 IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，是一种乳糖类似物，比乳糖有更强的诱导作用。 LacZ基因：编码半乳糖苷酶的基因，能够表达检测剂 X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。 用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因，lacz中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性. 虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。 操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。 以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片断）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出： 未转化的菌不具有抗性，不生长； 转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落； 转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。 * * pGEM-T Easy Vector 载体环形图谱 半乳糖 5-溴-4-靛蓝 蓝色 α互补的检测 *