血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定ppt课件.pptVIP

* 亲和层析：利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离 离子交换层析：固定相是离子交换剂的层析分离技术。样品中待分离的溶质离子，与固定相上所结合的离子交换，不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱。 * 盐析：在蛋白质溶液中加入大量的中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，而使蛋白质从溶液中沉淀析出的方法 对分离目的蛋白的盐析，最好采用分段盐析。由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同，沉淀时所需的pH值与离子强度也不相同，改变盐的浓度与溶液的pH值，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开，这种分离蛋白质的方法称为分段盐析法(fractional saltingout)。 * 蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向阳极移动的速度不同。经过一定的电泳时间后可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组迁移率相近似的蛋白质。 * 硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分段盐析效果好，不易引起变性。溶液pH约4.5～5.5，可用硫酸/氨水按需要调节pH值。 * 共沉：欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来 * 常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50过柱，用时较短。 实验三 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 层析技术（Chromatography) 层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 用色彩（chroma）和 图谱（graphs）组成 色谱一词 （Chromatography) 层析技术（Chromatography) 依据：混合物中各组分的理化性质差异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。 基本原理 固定相—固定不动流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。 分类 ①流动相的物理状态：气相和液相→ 气固/液，液固/液②操作方式：纸、薄层、柱③分离原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相 凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析) 定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。 基本原理： 固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。流动相：洗脱液 凝胶层析的基本原理 交联葡聚糖凝胶 其商品名为Sephadex G系列 G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10倍或吸水量（g）/10g干胶。 交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。 影响因素 *层析柱的选择及装填： 柱大小—分离样品量 凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子 *洗脱液：溶解待分离物质，不变性 *加样量：1%～5% *凝胶的再生 蛋白质的分离依据 生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 蛋白质的胶体性质：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/有机溶剂沉淀 两性电解质和等电点：pH pI，蛋白质带负电；反之带正电→电泳、离子交换层析 有一定的功能：抗