高级生化基因.docVIP

生物物理 陈洪阳 220100906081 NF-κB的激活蛋白——Act1 Xiaoxia Li*, Mairead Commane?, Huiqin Nie*, Xianxin Hua?, Moitreyee Chatterjee-Kishore?, David Wald?, Michael Haag?, and George R. Stark?§ NF-κB依赖的选择性标记的应用促进了含有cDNA编码的Act1（一种激活NF-κB的蛋白）的细胞系的分离。Act1与IκB酶（IKK）相互联系并激活IκB酶，使得NF-κB从NF-κB—IκB复合体上分离下来。许多使得NF-κB释放的信号通路都可以通过Jun 酶（JNK）激活转录激活因子（ATF）和蛋白激活因子1（AP-1）。Act1也能够激活JNK，这表明Act1可能是激活NF-κB和JNK的多功能复合体的一部分。Act1在IL-1（白介素1）无应答但是所有已知信号组成都存在的的突变体细胞系中不能够激活NF-κB，这表明NF-κB是与IL-1信号途径中未知的组分相互作用的。 转录因子Rel家族的成员，尤其是NF-κB，在免疫和炎症反应、细胞生存，以及许多细胞和病毒基因表达调控方面的压力应答中发挥重要的作用。在许多细胞类型中，NF-κB以惰性状态存在于胞质中，这种惰性是通过与IκB抑制蛋白相互作用而实现的。在一定的细胞因子激活下（如，白介素1和肿瘤坏死因子α【TNF-α】）、其他试剂（如佛波酯或双链RNA）刺激下或是脂多糖或其他配体激活Toll受体后的应答过程中，IκB蛋白的丝氨酸残基特异型的磷酸化，随后泛素化，很快的降解。NF-κB被释放转移至细胞核激活转录。另外，激活p65/p50NF-κB异二聚体的亚基p65的转录激活域，用来应答很多或是所有相同的信号，更大程度的加强了转录应答。 许多信号可以激活NF-κB与高分子量寡聚蛋白—丝氨酸特异性的IκB酶（IKK）进行聚集。IKK至少由三部分亚基构成：催化亚基IKKα和β、调节亚基IKKγ。IKKα和β含有非常相似的一级结构（52%的一致性），接近N端是蛋白酶区域，接近C端是亮氨酸拉链和螺旋-环-螺旋结构。IKKγ缺乏酶的位点但是包含一段卷曲螺旋序列，用来构成蛋白-蛋白结合，包括C端亮氨酸拉链结构。IKKγ是如何参与IKK信号的过程还是未知的，但是这种调节蛋白已经被报道与细胞激活信号的应答的上游组分相互作用。虽然IKK可被有丝分裂激活蛋白激酶(MAP3K)家族的成员激活，包括细胞外信号调节激酶1（MEKK1）和NF-κB诱导酶（NIK），但是IKK上游激活者的身份仍然在被确定中。IL-1，TNF-α以及其他相关的信号途径也能通过激活Jun酶（JNK）而激活转录激活因子（ATF）和蛋白激活因子1（AP-1）。诱导形成的信号激活JNK可能与NF-κB激活在一些适配蛋白（肿瘤坏死因子受体相关因子，TRAFs）方面不同。活化的TRAFs能够激活MEKK1，然后MEKK1依次激活JNK. 在这篇文章中，我们提出一个方法：克隆NF-κB依赖性信号途径的新的组分。在人肾胚细胞系293中，一个含有NF-κB上游区段的人类IL-1-应答基因E-selectin被用来驱动蛋白的表达，它提供了zeocin（Zeo）抗性和对单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK）敏感性。293-TK/Zeo细胞，提供了应答IL-1的TK表达的阴性选择，这被用来分离IL-1不应答的突变细胞系。在这里，我们显示了相同的细胞被用来克隆cDNA，cDNA的表达将导致NF-κB的激活，用Zeo进行选择。这样的cDNA编码的NF-κB激活者1（Act1）就是一种激活NF-κB和JNK途径的蛋白。 材料和方法 生物试剂及细胞培养. 重组人IL-1β由国家肿瘤协会提供。IKKγ的单克隆抗体由Tularik（南旧金山，CA）的Dr.Zhaodan Cao惠赠，抗磷酸化-JNK来自新英格兰生物实验室，抗IKKα来自Santa Cruz Biotechnology，抗M2来自Sigma。293-TK/Zeo细胞用DMEM培养基培养，供以10%胎牛血清，青霉素G（100ug/ml）,链霉素（100ug/ml）。 逆转录病毒cDNA文库和细胞转染 HaCaT逆转录病毒cDNA文库从Harvey Lodish(Whitehead Institute, Cambridge,MA; ref. 19)的实验室获得，在Escherichia coli中得到富集，然后引入到包装细胞系Bosc23中以获得高浓度的逆转录病毒cDNA文库。我们用转染的方法提取病毒悬液（上清），在60mm的培养皿中转染大约2*106个Bosc细胞，起初与5μg的DNA文库培养24小时。转染48小时后重新获得的悬液上清，立即用来转染或是用干